复方黄柏温敏凝胶的制备和连翘苷含量测定

刘姗姗，王志君，刘继勇，潘勇华，舒 薇，尤本明*

（1.第二军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.上海市闸北区中心医院药材科，上海 200070）

复方黄柏温敏凝胶的制备和连翘苷含量测定

刘姗姗1，王志君1，刘继勇1，潘勇华1，舒 薇2，尤本明1*

（1.第二军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.上海市闸北区中心医院药材科，上海 200070）

目的：筛选复方黄柏温敏凝胶的最优处方，建立测定其中连翘苷含量的HPLC法。方法：以泊洛沙姆407（P407）和泊洛沙姆188（P188）为基质制备复方黄柏温敏凝胶，通过相变温度和黏度筛选最佳处方。HPLC法测定所用色谱柱：Hypersil ODS2-C18柱（150mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈:水（22:78），流速为1.0ml/min，检测波长277nm，柱温30℃。结果：最优处方为P407:P188＝18:1作为基质，相变温度为27.17℃，黏度为15.31Pa·s。建立的HPLC法回收率、精密度和稳定性良好，测得3批复方黄柏温敏凝胶中连翘苷含量为（0.74±0.05）mg/g（n＝3）。结论：复方黄柏温敏凝胶符合临床应用要求。建立的HPLC法准确、稳定、专属性强，可用于复方黄柏温敏凝胶中的连翘苷含量测定。

复方黄柏温敏凝胶；连翘苷；含量测定；色谱法，高效液相

［Pharm Care Res，2015，15（4）：269-272］

复方黄柏液由连翘、黄柏、金银花、蒲公英和蜈蚣制成，具有清热解毒、消肿止痛、祛腐生肌、抗菌消炎、促进伤口愈合的作用。该药适用于骨髓炎、骨结核窦道、脉管炎等疑难病及疮疡溃后外伤感染等常见病，是化脓性感染、促进创面愈合的外用液体制剂［1，2］。复方黄柏液的缺点是药效维持时间短，需用纱布湿敷［2］，使用不方便，而且容易造成伤口二次感染。普通凝胶剂涂抹不方便，尤其对于大面积及深度创面，无法保证涂抹均匀，且涂抹过程中容易损伤创面，不利于创面愈合，而温敏凝胶能有效避免此类情况发生。温敏凝胶是以溶液状态给药后，在用药部位立即发生相转变，由液态转化形成非化学交联的半固体凝胶［3］。温敏凝胶可通过皮肤、眼部、鼻腔、口腔、阴道、直肠等多种途径给药，黏附于给药部位，延缓药物释放，有效提高生物利用度，是目前新型给药系统的研究热点之一，尤其适合做各种中药提取物的给药载体［4，5］。本研究以泊洛沙姆407（P407）和泊洛沙姆188（P188）为基质，制备复方黄柏温敏凝胶，并采用HPLC法测定其中连翘苷的含量。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Gemini2流变仪（Bohlin Gemini公司）；LC-10ADVP高效液相色谱仪，包括LC-10AT泵、SPD-10A紫外检测器、CTO-10A柱温箱、CLASS VP色谱工作站和SCL-10Avp系统控制器（日本岛津制作所）；FA-2004电子天平（上海精科天平仪器厂）；5804R型高速冷冻离心机（美国Eppendorf公司）。

1.2 试剂和药品 P407和P188（德国BASF公司）；连翘苷对照品（含量95.3%，批号110821-201213，中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；复方黄柏原液（批号1312121，山东汉方制药有限公司）；蒸馏水（第二军医大学长海医院制剂室自制）。

2 方法和结果

2.1 温敏凝胶的制备 用冷溶法制备复方黄柏温敏凝胶［5］，在搅拌的条件下将处方量的P407和P188缓慢均匀地撒在水面上，然后置于4℃冰箱冷藏24h，使其充分溶胀，得到澄清、无团块、分散均匀的凝胶溶液。在搅拌的条件下加入处方量的复方黄柏原液，即得复方黄柏温敏凝胶。

2.2 流变学参数测定 采用Gemini2流变仪测定复方黄柏温敏凝胶在32℃的黏度，并从15℃升温至55℃确定相变温度。升温速度1℃/min，样品温度精确控制在±0.1℃内，震荡频率0.5Hz，应变幅度设定为1.0%，40mm锥板，间隙0.5mm。

2.3 处方的筛选 分别采用不同比例的P407（18%、19%、20%）和P188（2%、4%和6%）为基质，按2.1项下方法制备空白凝胶和复方黄柏温敏凝胶。测定不同处方制备的凝胶的相变温度和黏度［3，5］，结果见表1。由表1可见，单独使用P407作为基质时，相变温度呈现浓度依赖性，即P407浓度较高时相变温度较低，反之相变温度较高。固定P407的含量，少量P188可对相变温度产生影响。随着P188含量增加，相变温度逐渐上升。固定P407和P188的含量，与空白凝胶相比，复方黄柏温敏凝胶的相变温度更低。综合考虑相变温度、黏度和人体表皮温度，对P407含量为18%和19%的两个体系做进一步处方优化，见表2。

表2 精确优化处方的相变温度和黏度Table 2 Phase transition temperature and viscosity of the accurate optimized formula

预实验发现，相变温度为（27.5±0.5）℃的温敏凝胶在常温下为液态，而涂布到皮肤上呈凝胶状。因此由表2可见，以P407:P188（18:1和19:2.5）为基质制备的凝胶可满足临床治疗需求，提高病人用药依从性。进一步对比黏度曲线发现，P407:P188（18:1）处方的黏度曲线较为平缓，而P407:P188（19:2.5）处方的黏度随着温度升高逐渐升高（见图1），不利于制剂质量控制，因此最终确定以P407:P188（18:1）为最优处方。按照最优处方制备3批样品，测定其相变温度平均值为27.17℃，黏度平均值为15.31Pa·s。

2.4 连翘苷的含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS2-C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈:水（22:78），流速1.0ml/min，检测波长277nm，柱温30℃，进样量20μl［6］。

图1 复方黄柏温敏凝胶的黏度曲线图Figure 1 Viscosity curves of compound Phellodendron thermosensitive gel

2.4.2 溶液的配制 （1）对照品溶液：精密称取10.0mg连翘苷对照品置100ml容量瓶中，用适量50%甲醇溶解并定容至刻度，得100μg/ml的连翘苷对照品母液。（2）供试品溶液：精密称取1g复方黄柏温敏凝胶置100ml容量瓶中，用适量50%甲醇稀释，1.22×104×g离心5min。取1ml上清液置10ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，得供试品溶液。（3）阴性对照溶液：制备不含连翘的复方黄柏温敏凝胶作为阴性对照品，按供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液分别进样测定，得到色谱图见图2。由图2可见，处方中其他成分对连翘苷色谱峰无干扰。

图2 连翘苷的HPLC谱图Figure 2 HPLC photograms of forsythin

2.4.3 线性关系的考察 分别精密量取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml连翘苷对照品母液置100ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，得到系列浓度为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg/ml的对照品溶液。按2.4.1项下色谱条件，测定峰面积（A）。以A对浓度（c）做线性回归，得标准曲线方程A＝30 114c-186.86（r＝0.999 8，n＝6），表明连翘苷在0.2～2.0μg/ml范围内线性关系良好。

2.4.4 回收率实验 分别取适量已知浓度的供试品溶液与低、中、高浓度（0.4、0.8、1.2μg/ml）的对照品溶液混合摇匀，得到低、中、高浓度分别为0.57、0.77和0.97μg/ml的溶液。按2.4.1项色谱条件进样测定，记录峰面积，代入标准曲线方程计算含量及回收率。得到低、中、高浓度连翘苷的回收率分别为（98.39±0.33）%、（98.57±0.45）%、（98.65±0.26）%（n＝3）。

2.4.5 精密度实验 （1）日内精密度：分别取低、中、高浓度（0.4、0.8和1.2μg/ml）的对照品溶液各20μl，按2.4.1项色谱条件，重复进样3次，每次间隔时间4h，记录峰面积，计算得到低、中、高浓度连翘苷的日内RSD分别为1.67%、1.20%和0.39%（n＝3）。（2）日间精密度：取上述低、中、高浓度的对照品溶液，重复进样3次，每次间隔时间24h，记录峰面积，计算得到低、中、高浓度连翘苷的日间RSD分别为1.85%、0.29%和0.89%（n＝3）。

2.4.6 稳定性实验 将供试品溶液分别于配制后0、2、4、6和8h进样测定，记录峰面积，计算得到RSD＝0.73%（n＝5）。结果表明供试品溶液在配制后8h内基本稳定。

2.4.7 样品含量测定 取3个批号的复方黄柏温敏凝胶各3份，按2.4.2项（2）方法制备供试品溶液，按2.4.1项色谱条件测定峰面积，计算浓度。3个批号的复方黄柏温敏凝胶中连翘苷的平均含量为（0.74±0.05）mg/g（n＝3）。

3 讨 论

与传统的复方黄柏液相比，复方黄柏温敏凝胶以液态形式给药，在给药部位可以迅速形成凝胶，不仅给药方便，还可以起到缓释作用，提高了复方黄柏液的生物利用度，更可以有效防止二次感染。复方黄柏液的制备过程中有一个冷凝沉淀后过滤的步骤，部分药效成分会因为溶解度等原因大量损失，而温敏凝胶制备过程中将复方黄柏原液直接加入，药效成分充分保留，从而可以提高其有效成分含量。

对于相变温度的测定，文献报道多采用搅拌转子法［7］和眼观法［8］，但其主观性太强，缺乏科学性。本研究使用流变仪直接测定黏度和相变温度，结果更加客观、可信。空白凝胶加入复方黄柏原液后相变温度有所降低，推测原因是由于处方中水含量降低，而P407含量增加。另外，复方黄柏原液中其他成分也有可能影响温敏凝胶的相变温度。

连翘是复方黄柏液的主要成方药材之一，其中的连翘苷具有清热、解毒、散结排脓等功效［1］。本研究采用HPLC法测定连翘苷含量，以乙腈-水（22:78）为流动相，成功使连翘苷和杂质达到有效分离，并且保留时间较为合理。样品提取时曾参考文献［3］，但其所用的提取溶剂与温敏凝胶基质会发生反应而凝固，改用50%甲醇作为提取剂未见此现象，且满足含量测定方法学的要求，故最终以50%甲醇作为提取剂。本研究建立的HPLC法准确、稳定、专属性强，适用于测定复方黄柏温敏凝胶中连翘苷的含量。

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Preparation and forsythin content determination of compound Phellodendron thermosensitive gel

LIU ShanShan1，WANG ZhiJun1，LIU JiYong1，PAN YongHua1，SHU Wei2，YOU BenMing1*
（1.Department of Pharmacy，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；2.Department of Pharmacy，Central Hospital of Zhabei District of Shanghai，Shanghai 200070，China）

Objective：To screen the optimal formula of compound Phellodendron thermosensitive gel and establish a HPLC method for content determination of forsythin in it.Methods：Compound Phellodendron thermosensitive gel was prepared using poloxamer 407（P407）and poloxamer 188（P188）as matrix. The optimal formula was chosen according to the phase transition temperature and viscosity. The HPLC method was applied on a Hypersil ODS2-C18analytical column（150mm×4. 6mm，5μm），with the mobile phase consisting of acetonitrile-water（22:78）at a flow rate of 1. 0ml/min. Detection wavelength was 277nm and the column temperature was 30℃.Results：The optimal formula was using P407:P188（18:1）as matrix. The phase transition temperature was 27. 17℃and the viscosity was 15. 31Pa·s. Recovery，precision and stability of the HPLC method were all good. Content of forsythin determined in the three batches of compound Phellodendron thermosensitive gel were（0. 74±0. 05）mg/g（n＝3）.Conclusion：The compound Phellodendron thermosensitive gel conforms to the requirements of clinical application. The HPLC method is accurate，stable，specific and can be used for forsythin content determination of compound Phellodendron thermosensitive gel.

compound Phellodendron thermosensitive gel；forsythin；content determination；chromatography，high performance liquid

R944.9，R927.2 ［

］ A ［

］ 1671-2838（2015）04-0269-04

10.5428/pcar20150410

2015-05-29

］ 2015-07-16

上海市药理学会皮肤药理学专业委员会汉方中医药皮肤病学研究基金（201301），上海市卫生局科研课题（20120481）

刘姗姗（女），药师.E-mail：xuesong633@sina.com；王志君（女），主管药师.E-mail：wl19521957@126.com；两人为共同第一作者

尤本明，E-mail：bmyoush@126.com

［

［本文编辑］ 兰芬