粪便隐血胶体金法和氨基比林法的对比及意义

伍志莲，赖书台

(韶关市曲江区人民医院检验科，广东 韶关512100)

2011年美国癌症学会(American Cancer Society，ACS)最新发布的全球癌症统计报告称，食管、胃、肝脏、结直肠等消化系统脏器的癌症发生率和死亡率在发展中国家均占前十位[1]。上消化道出血量小于5ml时肉眼看不到血液存在；红细胞受到破坏时，粪便显微镜检查也见不到红细胞；此时只有通过粪便隐血试验才能证明有无出血。在临床的日常诊疗中粪便隐血试验非常重要。许多临床研究证明，粪便微量出血是结肠直肠癌最早期的症状。所以对粪便中微量出血的检出尤其是在胃肠消化道肿瘤及出血的早期诊断方面具有十分重要的意义。我们在临床检验工作中经常遇到黑色柏油样粪便隐血试验阴性，而临床上高度怀疑上消化道出血的情况。为了解其原因，我们做了胶体金免疫法和氨基比林半定量法(化学法)的粪便隐血试验对比，并对其结果进行了分析。

1 材料与方法

1.1 一般资料 2013年1月至2014年12月间我院住院及门诊确诊为上消化道出血的患者的黑色柏油样粪便100例，同时段正常外观黄色软粪便100例(健康者提供)。患者年龄在25~90岁之间，平均年龄45岁，男61例，女39例。

1.2 试剂

1.2.1 便隐血(FOB)检测试剂(胶体金法)由艾博生物医药(杭州)有限公司提供。

1.2.2 氨基比林半定量法 (化学法)试剂：(1)5%氨基比林溶液：称取氨基比林5克溶于50ml冰醋酸和50ml无水乙醇的混合液中摇匀，置棕色瓶中保存。(2)3%过氧化氢溶液：吸取10ml30%过氧化氢溶液加90ml蒸馏水混匀。置棕色瓶中保存(注意3%过氧化氢容易失效，试验时应做阳性对照)。

1.3 方法

1.3.1 便隐血(FOB)检测试剂(胶体金法)检测原理采用双抗体夹心法，试剂含有被事先固定于膜上检测区(T)的抗人血红蛋白和质量控制区(C)的相应抗体。测试时，试剂插入样本中，随之在毛细效应作用下向上层析。如果粪便中含有人血红蛋白，则形成金标记抗人Hb单抗-粪Hb-羊抗人Hb多抗复合物[2]，在检测区(T)内出现一条紫红色条带(阳性结果)。如果粪便中无人血红蛋白，则检测区(T)内将无紫红色条带。无论人血红蛋白是否存在于样本中，一条紫红色带都会出现在质量控制(C)内。质量控制区(C)所显现的紫红色条带是判断是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。检测方法及注意事项均严格按试剂说明书操作，试剂在有效期内使用。操作：在样品杯中加入约0.5ml蒸馏水，用竹签挑取约火柴头大小的新鲜粪便标本放入杯内混匀；从包装纸中取出试剂条，将试剂条的箭头所指端浸入样本溶液中 (液面不能超过MAX标记线)，5~10min判读结果。

1.3.2 氨基比林半定量法(化学法)原理 血红蛋白中的亚铁血红素有类似过氧化物酶的活性，能催化H2O2作为电子受体使氨基比林氧化而显紫蓝色，其颜色的深浅与血红蛋白含量成正比。操作：用竹签挑取约火柴头大小的新鲜粪便标本，置于白色背景上，依次加2~3滴5%氨基比林溶液，2~3滴3%过氧化氢溶液。立即观察结果，在2min内出现紫蓝色为阳性。并根据颜色深浅记录(以“+”表示)。

1.3.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析，计数资料采用率表示，数据比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

正常外观黄色软便胶体金免疫法阳性率为8%(8/100)，氨基比林半定量法阳性率为2%(2/100)，两种方法同时阳性为0；黑色柏油样便胶体金免疫法阳性率为77%(77/100)，氨基比林半定量法阳性率为100%，胶体金法与氨基比林半定量法隐血试验的阳性率对照差异有统计学意义 (P<0.05)，见表 1。

表1 粪便隐血2种方法结果

3 讨论

美国临床化学学会[3]和中华医学会检验分会[4]均推荐粪便隐血试验作为结直肠癌的筛查指标。粪便隐血试验的方法主要有化学法、免疫法、血红蛋白荧光测定法、放射性核素铬(51Cr)法、转铁蛋白(Tf)法等。化学法主要包括邻联甲苯胺法、氨基比林法、愈创木酯法等；西班牙学者研究提示免疫法粪便隐血试验是目前结直肠癌筛查的最适合手段[5]。目前临床采用较多的免疫法是单抗免疫胶体金法，该方法被世界卫生组织胃肠镜检查协会推荐为粪便隐血试验的一种较为确认的方法[6]。其原理是胶体金是由氯化金和枸橼酸合成的胶体物质，呈紫红色。胶体金与羊抗人血红蛋白单克隆抗体(羊抗人Hb单抗)和鼠IgG吸附在特制的乙酸纤维膜上，形成一种有标记抗体的胶体金物质，再在试带的上端涂上包被羊抗人Hb多抗和羊抗鼠IgG抗体[2]作为试剂质控对照线。氨基比林半定量法的特点是中灵敏度、中特异性，Hb 1~5mg/L即可检出，消化道有5~10ml出血即为阳性[2]。从表1可以看出当粪便外观呈正常黄软便时氨基比林半定量法阳性有2例，胶体金免疫法阳性有8例。两种方法同时阳性为0；可见胶体金免疫法灵敏度高于氨基比林半定量法，当粪便外观呈黑色柏油样便时氨基比林半定量法阳性100例(100%)，胶体金免疫法阳性77例(77%)。此时氨基比林半定量法的灵敏度高于胶体金免疫法。可见氨基比林半定量法可以满足临床需求。

表中还可看出，在黑色柏油样粪便中胶体金免疫法有23例阴性。说明胶体金免疫法存在假阴性。其原因可能有以下几个方面：上消化道出血量大时Hb浓度过高，Hb、Hb-Hb抗体复合物和抗Hb竞争结合，抑制了胶体金颗粒聚集(后带现象)，导致假阴性[7]，此时可稀释粪便标本再复查；患者的血红蛋白抗原与单克隆抗体不相匹配而出现假阴性[8]；粪便标本中的红细胞或Hb在消化道内时间较长时，珠蛋白链可能会被胃液及蛋白酶水解和降解破坏，从而失去能特异结合单克隆抗体的抗原决定簇，使其失去免疫原性而出现假阴性[9]；还有可能触珠蛋白和糖化血红蛋白等屏蔽抗原决定簇从而引起假阴性；此外，胃肠道内的各种细菌作用也有可能使血红蛋白失去免疫活性，导致假阴性。

化学法隐血试验易受多种因素影响而呈假阳性反应[10]。试验结果显示，黄色软便中氨基比林半定量法阳性2例，可能是食入动物肉类、铁剂等产生的假阳性；胶体金免疫法阳性8例临床证实有不同程度的胃溃疡、痔疮等。总之，在临床诊疗中必须了解各种方法的局限性。如免疫法不受动物血红蛋白的干扰，而化学法无法排除此干扰[11]，林召等[12]认为免疫金标法隐血试验主要检测下消化道出血,约有40%~50%的上消化道出血不能检出，高于本文的23%。由于免疫法只能定性检测，而化学法大致能估计出血量(半定量)，且利于观察消化道出血病人的疗效。因此,化学法检查上消化道出血(胃、十二指肠等)可靠[13]。胶体金免疫法的特异性只针对粪便中的人血红蛋白,当样品中血红蛋白浓度超过0.2μg/ml时，就可得到阳性结果[14]，而且此实验不受其它动物肉类血红蛋白干扰，含过氧化物酶的新鲜蔬菜,铁剂,维生素C及对化学法有干扰作用的某些药物对此法的结果均无影响[15]。所以在日常临床工作中应该以胶体金法作为主要隐血检测手段[16]。当黑色柏油样便胶体金法阴性时，可以通过氨基比林半定量法(化学法)纠正结果，以提高粪便隐血的准确性。

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2]丛玉隆,尹一兵,陈瑜.检验医学高级教程[M].北京:人民军医出版社,2012:180-182.

[3]Sturgeon CM,Duffy MJ,Stenman UH,et al.National academy of clinical biochemistry laboratory medicine practice guidelines for use of tumor markers in testicular,prostate,colorectal,breast,and ovarian cancers[J].Clin Chem,2008,54(12):e11-79.

[4]中华医学会检验分会,卫生部临床检验中心,中华检验医学杂志编辑委员会.肿瘤标志物的临床应用建议[J].中华检验医学杂志,2012,35(2):103－116.

[5]Quintero E.Chemical or immunological tests for the detection of fecal occult blood in colorectal cancer screening?［J］.Gastroenterol Hepatol,2009,32(8):565－576.

[6]Young GP,St John DJ,Winawer SJ,et al.Choice of fecal occult blood tests for colorectal cancer screening:recommendations based on performance characteristics in population studies:a WHO(World Health Organization)and OMED(World Organization for Digestive Endoscopy)report[J].Am J Gastroenterol,2002,97(10):2499-2507.

[7]黄胜,梁华英,何艳,等.三种粪便隐血试验的临床应用评价[J].实验与检验医学,2011,29(1):69-70.

[8]吴新宏.上消化道出血而免疫法粪便潜血阴性一例[J].实用医技杂志,2010,17(1):95.

[9]路爱丽,齐振普,张敏.联合应用免疫法与化学法潜血试验对胃出血的诊断价值探讨[J].检验医学,2013,28(8):723-725.

[10]熊立凡,刘成玉.临床检验基础[M].第4版.北京:人民卫生出版社,2010:201-211.

[11]顾兵,郑明华,陈兴国.检验与临床的沟通—案例分析200例[M].北京:人民卫生出版社,2011:91-92.

[12]林召,肖正勤,李江,等.两种粪便潜血试验的临床应用与评价[J].检验医学与临床,2011,8(2):216-217.

[13]孙彩林,袁明凤.邻联甲苯胺法和单克隆抗体法检测粪便隐血的应用评价[J].检验医学与临床,2011,8(20):2526-2527.

[14]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京:东南大学出版社,2006:310-311.

[15]马炳云,杨明,丛玉隆.金标法单克隆抗体法便潜血检测方法学探讨[J].中华医学检验杂志,1998,21(1):48.

[16]邓光权.胶体金法和联苯胺法在检测粪便隐血中的应用[J].实用医技杂志,2013,20(7):758-759.