急性髓系白血病患者循环micro RNA-335的检测及其临床意义

黄淑英，鲁勇，刘静

(1、南昌大学第二附属医院检验科，南昌330006；2、新建县人民医院，江西 新建 330100)

急性髓系白血病 (acute myeloid leukemia,AML)是一种以骨髓中异常的原始细胞和幼稚细胞大量增殖并抑制正常造血为特征的高度异质性的恶性血液病[1]，其死亡率在全国各年龄段恶性肿瘤死亡率中名列前茅，居儿童和35岁以下成人恶性肿瘤死亡率的榜首[2]。临床上，AML的早期正确诊断对疾病的治疗、预后、疗效观察均有十分重要的意义，目前除了国际上统一的急性白血病传统的FAB形态学分型和MICM(Morphology,lmmunology,Cytogenetics,Molecular biology)分型外，寻找新的无创诊断与分型的生物学标志物也是当今研究者所关注的焦点[3]。

microRNA是新近发现的一类在转录后调控基因表达的小分子RNA，研究表明它与急性白血病的发生发展密切相关，且在不同的类型中呈特征性表达，因此在白血病的诊断治疗方面有极大的潜力[4,5]。最近研究发现，microRNA-335在不同肿瘤中分别发挥着抑癌基因和促癌基因的作用，参与多条癌性信号通路的调节[6]，在AML患者骨髓原始细胞中高表达[7]。但其在AML患者外周血中的表达情况及其临床意义尚无相关研究提及，本研究拟通过RT-PCR对AML患者循环miRNA-335的表达量进行测定并探讨其在AML中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 基本资料 本研究收集2010年1月-2012年12月南昌大学第二附属医院初诊未治疗AML患者。所有病例均按照张之南、沈悌主编《血液病诊断及疗效标准》第3版急性髓系白血病的诊断标准，联合基因、免疫表型、生物学、临床特点对疾病进行诊断。本研究经医院医学伦理学委员会批准，患者知情同意。所有病例均在入院未采取任何治疗时采集EDTA抗凝外周血2ml，离心分离血浆-80℃保存备用。

1.2 仪器与试剂 逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)，ABI7500荧光定量PCR扩增仪(美国 Applied Biosystems公司)，PCR扩增仪 (德国Biometra 公司)，Trizol(美国 Invitrogen 公司)，紫外分光光度计(日本岛津公司)。

1.3 总RNA的抽提 取1ml TRIZOL标本，加入200μl氯仿， 离心 12000g，15min； 取无色水相层500μl至新的EP管，加500μl异丙醇，冰上静置30min 后离心 12000g，15min；弃上清，与 1ml 75%乙醇混匀离心12000g，5min；再次弃上清，与1ml无水乙醇混匀离心12000g，5min；弃上清，干燥3~5min后用适量DEPC水溶解；检测RNAOD260/OD280比值及浓度，存-80℃备用。所有操作均在冰上进行，离心机设置温度4℃。

1.4 microRNA检测 合格RNA样本使用TaKaRa逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA并进行qRTPCR。 miRNA-335 上游引物：5’-GCG GTC AAG AGC AAT AAC GAA-3’，下游引物：5’-GTG CAG GGT CCG AGG TAT TC-3’；内参U6上游引物：5’-CTC GCT TCG GCA GCA-3’； 下游引物：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。

使用Takara SYBR Green II qRT-PCR试剂盒及ABI7500 PCR仪同时检测miRNA-335及U6，以 20μl体系扩增：2μl cDNA，Takara SYBR Premix Ex TaqTM II(2×)10.0μl，上下游引物各 1.0μl，ROX Reference DyeII(50×)0.4μl，5.6μl ddH2O。扩增条件为：95℃预变性 1min；95℃变性 5 sec，60℃退火 30 sec，共40个循环。qRT-PCR每次测定均设置3个复孔，以U6表达量为内参照标准，根据双delta法计算miRNA-335的相对表达量，计算公式为：(1)相对表达量=2-ΔΔCt；(2)ΔΔCt= (CtmiRNA-CtU6)MDS-(CtmiRNA-CtU6)control。目的miRNA的表达量以相对循环阈值(CT)进行评估，最终组间采用U6表达量校正后数值进行比较。本研究结果均以基因表达平均值±标准差(±s)表示。

1.5 统计分析 本研究采用SPSS 12.0软件行辅助分析。所有数据使用前均需要进行方差齐性检验。三组及以上资料比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较则采用LSD-t行方差齐性检验。如果资料对应总体方差不齐，可使用多个独立样本比较的Kruskall-Wallis H检验(三组及以上)或者Mann-Whitney U检验(两组)进行比较分析。P<0.05时认为差异具有统计学意义。

绘制miRNA-335表达量诊断AML的ROC曲线并计算曲线下面积AUC。AUC取值范围为0.5~1，一般认为AUC在0.5~0.7之间诊断价值较低，在0.7~0.9之间诊断价值中等，0.9以上认为诊断价值较高。

2 结果

2.1 纳入研究的病例特征 2010年1月至2012年12月收治急性髓系白血病患者共26例，男16例，女10例，年龄22~65岁，中位年龄38岁。外周血白细胞计数 1.6~263.9×109/L， 平均 13.6×109/L，稍高于正常值；外周血红细胞计数0.7~4.3×1012/L，平均2.6×1012/L，均出现程度不同的下降；外周血血小板计数 10.0~181.0×109/L， 平均 32.0×109/L，较正常水平显著降低；外周血淋巴细胞百分比5.0%~46.3%，平均15.0%，比例偏低；外周血原始细胞计数10.0%~95.0%，平均65.0%，骨髓原始细胞计数15.0%~94.5%，平均72.0%，均出现明显异常。纳入对照组为26例健康体检者，男、女各13例，年龄21~63岁，中位年龄34岁，均未曾被诊断为恶性或者其他良性疾病。其中包括FAB分型M1，M2，M3，M4，M5，见表 1。

表1 26例AML病例FAB分型

2.2 miRNA-335在AML患者与健康对照组的表达量比较 miRNA检测结果显示如图 1，26例AML患者miRNA-335表达量为3.70±1.21，健康对照组的miRNA-335表达量为1.78±0.35，两组间方差不齐，Mann-Whitney U检验结果概率P<0.001，差异具有统计学意义。

图1 AML患者与健康对照者miRNA-335表达量比较

2.3 miRNA-335在AML疾病中的临床意义 统计分析循环miRNA-335相对表达量在同组内纳入研究对象的年龄、性别比较上未见明显差异 (P>0.05)。与AML患者外周血白细胞计数及原始细胞计数无显著相关性(P>0.05)。与骨髓原始细胞计数及FAB分型无显著相关性(P>0.05)。

但我们绘制miRNA-335表达量诊断AML的ROC曲线并计算曲线下面积AUC后发现，当以相对表达量 2.7为 cutoff值时，miRNA-335诊断AML的 AUC可达0.915(95%可信区间：0.828~1.000；P<0.0001)，miRNA-335 诊断 AML 的敏感性可达80.8%，特异性可达100%，如图2所示。

图2 miRNA-335对成人AML诊断的SROC曲线

3 讨论

临床上急性白血病的诊断分型主要有FAB和MICM两种方法。前者操作简便、不需昂贵的仪器设备，但主观性强，分型准确率低，无法实现标准化和自动化操作。而WHO推出的MICM分型方法比单纯的形态学分型更为全面、合理，对治疗选择与预后判断具有更大的指导意义，但操作繁琐，费用昂贵。无论是MICM分型还是FAB形态学分型，其检测样本都需经过腰穿才能取得，增加了患者的痛苦和经济负担。故针对急性白血病，寻找无创诊断与分型的生物学标志物成为研究的热点。microRNA的发现是人类进一步认识肿瘤的里程碑，自miR-15a首次作为B型慢性淋巴细胞白血病(CLL)发病机理影响因素出现[8]，已有众多研究发现microRNA在肿瘤中诊断、治疗、分类、预后及风险评估方面的角色[9]。

本研究结果显示，在排除病例性别、年龄影响后，AML患者血清循环miR-335表达量显著升高，明显高于健康对照组，提示miR-335可作为AML诊断标志物之一。接着我们绘制ROC曲线并计算曲线下面积AUC，0.915的AUC证明miR-335对AML较高的诊断价值。选择最优的cutoff值(2.7)，miR-335正确诊断AML患者的概率为80.8%，而排除AML的概率达到100%。归纳起来，AML患者血清循环miR-335显著升高，对AML的诊断具有较高的诊断效能。与本研究结果相同，Lin等人首次发现miR-335水平在儿童AML患者的显著性高表达，提示miR-335可作为控制并预测临床儿童AML疾病发展的重要标志物[10]。

近年研究相继证实，众多miRNAs在AML中均存在着异常表达。miR-99a和miR-196b与儿童急性白血病的进展相关[11,12]；Ovcharenko和Bryant的研究均发现NPM1突变AML高表达miR-10a[13,14]；而Ling等发现AML患者进行外周血单个核细胞中miR-29a和miR-29b表达异常[15]；Amanda等人研究髓系白血病细胞系AML-193后也提示miR-590-5p、miR-219-5p、miR-15b 、miR-628-5p的表达与AML的发生相关[16]；同样，基因表达谱的筛查研究也提示miR-223和miR-222可能通过改变急性白血病致癌基因ETS1的表达而导致白血病发生[17,18]。我们猜测，这些异常表达的miRNAs均有作为AML特征性诊断标志物的潜力，这将有待于进一步的前瞻性研究进行证实。

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