TSLP基因的原核表达载体的构建

廖智萍，郭永清（通讯作者），方文旭，蔡志福

（1.莆田学院附属医院 耳鼻咽喉科，福建莆田351100；2.厦门大学附属中山医院 耳鼻咽喉科，福建厦门361004）

TSLP基因的原核表达载体的构建

廖智萍1，郭永清2（通讯作者），方文旭1，蔡志福1

（1.莆田学院附属医院 耳鼻咽喉科，福建莆田351100；2.厦门大学附属中山医院 耳鼻咽喉科，福建厦门361004）

目的：构建TSLP基因的原核载体pGEX-4T-1／TSLP并将其转到大肠杆菌BL-21（DE3）中诱导表达，最后获得基因表达产物。方法：用PCR方法从含有TSLP全基因序列中扩增目的基因，将TSLP基因连接到pGEX-4T-1质粒上，并转到大肠杆菌BL21（DE3）中。最后检测TSLP基因。结果：经测序及PCR证实TSLP准确插入原核表达载体pGEX-4T-1中SDS-PAGE及Western blotting分析证明重组蛋白的分子量约为40KD。结论：成功构建表达了含有TSLP的原核重组载体，并在大肠杆菌中表达。

胸腺基质淋巴生成素（TSLP）；pGEX-4T-1／TSLP构建；重组载体

变应性鼻炎和鼻息肉是耳鼻咽喉科的常见病和多发病，近几年来其发病率呈上升趋势，变应性鼻炎是发生在鼻黏膜的变态反应性疾病，鼻息肉的发病机制至今不清楚，已有研究提示变态反应在鼻窦炎鼻息肉的发病中起了重要作用。胸腺基质淋巴生成素（TSLP）是最近研究比较热门的一种细胞因子，研究者表明TSLP与变应性疾病的发病密切相关［1，2］。本文试图通过获取TSLP基因重组载体，进一步探究TSLP的致病机制，进而希望为开发治疗变应性疾病的药物提供某些实验依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料：表达带有GST标签pGEX-4T-1载体。基因工程菌E.coli DH5α和BL21（DE3）（由厦门大学附属中山医院消化实验室赠送）。EcoRI、SalI限制性内切酶，T4DNA连接酶，Taq酶，以及PCR反应试剂盒为TaKaRa产品。DL15000 Marker、DNA Marker1，质粒提取试剂盒、DNA小量胶回收纯化试剂盒。异丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）以及氨苄西林均为大连宝生物工程有限公司产品。逆转入试剂盒（MBI），Mouse anti-TSLP单克隆抗体（R＆D公司），HRP标记Goat anti-Mouse IgG，ECL为杭州联科生物技术有限公司。其它试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物合成：参考GenBanK中TSLP全长基因的序列，应用primer primier5.0设计一对可扩增TSLP基因开放读码框区域的引物：上游引物PF：5＇-CCGGAATTCCGGGTGTCCACGTATGTTC-3（画线部分为EcoRI的酶切位点），下游引物PR：5＇-CCGGTCGACGATGGTTTACTGTTGTTTCAG-3＇（画线部分为的SalI酶切位点），（由上海英骏生物工程有限公司合成）。

1.2.2 目的基因的扩增：人鼻黏膜上皮细胞总RNA的提取：按Trizol试剂盒所述方法提取人鼻黏膜RNA。-80℃，保存备用。以Oligo（dT）18为引物，遵循cDNA Synthesis System操作步骤合成cDNA。以cDNA为模板，以人TSLP基因的引物进行PCR扩增，扩增反应的条件为：95℃预变性2min，以95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环后，再于72℃延伸10min。同时设立无模板的阴性对照。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的DNA片段的胶条用胶回收试剂盒回收。

1.2.3 重组质粒pGEX-4T-1／TSLP的构建与鉴定：将纯化的PCR产物和载体pGEX-4T-1用EcoRI和SalI双酶切后，分别回收酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下定向将TSLP基因片段与pGEX-4T-1连接，将连接产物转化入DH5α感受态细菌，在LB（Amp＋）培养基中筛选培养。挑取克隆，培养后小量提取质粒，用EcoRI和SalI双酶切鉴定筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定：（1）重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE分析：将鉴定成功的重组质粒DNA转化感受态细菌E.coli BL21，在LB（Amp＋）培养基中筛选培养。将含有重组表达质粒的E.coli BL21在LB（Amp＋）培养液中，37℃振荡培养过夜。以1%接种于LB（Amp＋）培养液中，于37℃培养至A600nm约为0.6时，加入1 mmol／L IPTG，于30℃继续诱导培养4 h。离心收集菌体，经超声碎菌后，提取菌体全蛋白，将菌体全蛋白进行SDS-PAGE（浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12%）分析后，用考马斯亮蓝R250染色30min，用甲醇-冰醋酸脱色液脱色后观察结果。另外，取诱导前和诱导后2、4、6h的裂解菌液及超声裂解菌离心后的上清和沉淀，分别进行12%SDS-PAGE，分析目的蛋白的表达与诱导时间的关系，以及目的蛋白的表达形式。（2）Western blot分析：将表达产物经SDS -PAGE后，电转移至聚偏氟乙烯（PVDF）上，用封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST）室温振荡封闭2 h。依次滴加Mouse anti-TSLP单克隆抗体（室温反应1.5 h）及HRP标记Goat anti-Mouse IgG（室温反应1 h），用ECL化学发光试剂盒底物液显色后，观察结果。

2 结果

2.1 TSLP基因的扩增与鉴定结果：人鼻黏膜上皮细胞TSLP基因进行PCR扩增，所获产物在2g／L琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，在紫外灯下观察到1条约500bp的带，同预期的目的片段的大小相符（图1）。

图1 TSLP基因片段PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定［M：DNA marker；1.2：PCR产物；3：阴性对照（without TSLP tem-plate）］。

图2 重组质粒pGEX-4T-1／TSLP的酶切鉴定（1.pGEX-4T-1／TSLP／EcoRI、SalI；2.pGEX-4T-1／TSLP／EcoRI；3.pGEX-4T-1／TSLP／SalI M：MAKER）

2.2 重组质粒的构建与鉴定结果：重组质粒pGEX-4T-1／TSLP的构建图略。将重组质粒pGEX-4T-1／TSLP用EcoRI、SalI分别进行单酶切及双酶切，pGEX-4T-1的大小约为4.9 kb，扩增产物TSLP基因的大小约为509bp，线状重组质粒的大小为5.4kb，说明重组质粒大小正确。pGEX-4T-1／TSLP经EcoRI、SalI双酶切后，分成4.9 kb和0.5 kb两个片段，同预期值相符，表明目的基因已正确插入pGEX-4T-1载体中（图2）。阳性重组质粒测序结果在NCBI网进行BLAST分析比对，与GenBank登入的基因的序列完全一致（图3）

图3 阳性重组质粒测序图

图4 GST-TSLP融合蛋白的SDS-PAGE分析［1.no induced pGEX-4T -1／TSLP；2.induced pGEX-4T-1／TSLP（2h）；3.induced pGEX-4T-1／TSLP（3h）；4.induced pGEX-4T-1／TSLP（4h）；5.induced pGEX-4T-1／TSLP（5h）；］

2.3 GST-TSLP融合蛋白的表达与鉴定结果：以重组质粒转化感受态E.coli BL21，挑取阳性克隆后进行酶切鉴定。将经IPTG诱导表达的产物用SDS-PAGE分析。结果表明，在Mr为40KD处有1条明亮带，同预期的目的蛋白的Mr相符，Mr 26KD处条带为融合蛋白GST-TSLP受细菌内蛋白酶的作用而降解产生的GST蛋白。表达时间分析表明，目的蛋白在诱导4 h时表达量最高（图4）。表达形式分析表明，目的蛋白大多以可溶性非包涵体形式存在于胞质中。将融合蛋白GST-TSLP经SDS-PAGE后，电转移至PDVF膜上，用抗TSLP抗体检测显示，在Mr为40 KD处有1条明显的带，预计TSLP的大小约14KD（图5）。

图5 GST-TSLP融合蛋白的Western blot分析（1.2均为GST-TSLP融合蛋白，大小约40KD）

3 讨论

变应性疾病是一个多因素、多环节、多阶段的复杂疾病，随着对鼻息肉和过敏性鼻炎的基础研究日益深入，我们认识到其发病和转归有许多复杂的细胞、细胞因子、细胞间信号转导通路和大量免疫活性物质参与。TSLP基因是1994年 Friend等首次从胸腺基质细胞中鉴定出来，由A、B、C、D 4个螺旋束组成短链的I型细胞因子，研究表明，TSLP对淋巴细胞的发育、分化，尤其对树突状细胞的活化、分化起着重要的调控作用［3-4］，研究显示受TSLP作用而被激活的CD11C＋DC，可促进幼稚CD4＋T细胞增殖，分泌大量IL-4，IL-5及TNF-α。同时，CD8＋T细胞在TSLP激活DC的作用下，可产生大量INF-γ，IL-5和IL-13。INF-γ，IL-5和IL-13水平的升高，可导致炎性反应的加剧以及组织损伤，表明TSLP可能是炎症发生过程中一个重要的启动因子。鉴于TSLP具有的重要的免疫学功能及生理、病理学意义，探究TSLP在变应性疾病中的发生机制，因此寻找新的治疗方案及将多种治疗方法联合应用是变应性疾病治疗研究的热点。

选择有效的表达系统是进行外源基因高效表达的重要前提，本研究中利用分子克隆技术研究TSLP在原核基因的表达，明确诱导表达条件和目的蛋白的大小，因表达量是随着诱导剂量的增高而增高，但诱导剂对宿主菌有一定的毒害作用。我们将诱导时间定为2～6h，分别用9个不同终浓度的IPTG诱导。电泳分析，确定1mmol／L为最佳浓度。本实验采用1 mmol／L IPTG诱导浓度，分别诱导2～6h，电泳分析，确定4h为最佳诱导时间。外源基因表达为融合蛋白，分子量约为40 kD，在SDS-PAGE胶上的表观分子量基本符合此值，其中表达产物的N末端有一段含有GST标签的融合蛋白，大约为26 kD，此标签有利于目的蛋白的纯化。表达的GSTTSLP融合蛋白可用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析的方法纯化，GST序列后有一个可被凝血酶和Xa因子识别的蛋白酶切位点，通过蛋白酶的切割可产生天然的TSLP蛋白，为研究其抗原性提供了必要的条件。

本试验成功构建表达了含有TSLP的原核重组载体，并在大肠杆菌中表达，通过本试验所摸索的培养条件，我们可获得足够的融合蛋白，为进一步研究TSLP的抗原性和其抗体的免疫保护性奠定基础，为TSLP在变态反应性疾病的发病机制和临床应用等方面的研究提供了一定的理论和实验依据。

［1］Wang Y H，Liu Y J.Thymic stromal lymphopoietin，OX40-ligand，and interleukin-25 in allergic responses［J］.Clinical and Experimental Allergy，2009，86：236.

［2］Harada M，Hirota T，Jodo AI，et al.Functional analysis of the thymic stromal lymphopoietin variants in human bronchial epithelialcells［J］.Am J Respir Cell Mol Biol.2009，71：236.

［3］Yong-Jun Liu.Thymic stromal lymphopoietin：master switch for allergic infl ammation［J］.The Journal of Experimental Medicine，2006，122：310.

［4］Liu YJ，Soumelis V，Watanabe N，et al.TSLP：an epithelial cell cytokine that regulates T cell differentiation by conditioning dendritic cell maturation［J］.Annual Review of Immunology，2007，106：281.

Construction of prokaryotic expression vector of TSLP gene

Liao Zhiping1，Guo Yongqing2（correspondence author），Fang Wenxu1，Cai Zhifu1
1.Department of Fujian，Putian 351100；2.Department of Zhongshan hospital，hospital，Xiamen，Fujian，China 361004

Objective：to build arrives at genetic prokaryotic carrier pGEX-4 t-1／arrives and transfer them to the e.coli BL-induced expression in21（DE3），finally get the gene expression product.Methods：from containing arrives at full genetic sequence by polymerase chain reaction（PCR）amplification of gene，connect the arrives at gene plasmids pGEX-4 t-1，and go to the e.coli BL21（DE3）.Finally arrives at DNA.Results：confirmed by sequencing and PCRarrives accurately inserted into the prokaryotic expression vector pGEX-4 t-1 in sds-page and Western blotting analysis shows that the molecular weight of the recombinant protein is about 40 kd.Conclusion：successful build containing arrives at the prokaryotic recombinant expression vector，and expressed in escherichia coli.

Thymic stromal lymphopoietin（TSLP）；pGEX-4T-1／TSLP construction；recombinant carrier

R596

A

1002-2376（2015）10-0001-02

2015-08-25