超声波嫩化处理对淘汰蛋鸭中钙激酶活性影响的研究

秦卫东，马利华，陈学红，王嘉俊

(徐州工程学院食品工程学院,江苏徐州 221000)

超声波嫩化处理对淘汰蛋鸭中钙激酶活性影响的研究

秦卫东，马利华，陈学红，王嘉俊

(徐州工程学院食品工程学院,江苏徐州 221000)

采用不同功率及不同处理时间研究了超声波嫩化淘汰蛋鸭胸肉的效果。结果表明:超声波处理可以提高钙激活酶的活性,通过钙激活酶对肌原纤维蛋白质的水解作用降低肌肉的剪切力。超声波功率及超声波处理时间是决定嫩化效果的两个重要因素。淘汰蛋鸭胸肉最适的超声波嫩化条件分别为 300W功率、15min处理时间。相关分析证实钙激活酶活性与肌肉剪切力之间呈现负相关(R2>0.76)。

淘汰蛋鸭,超声波,嫩化,钙激活酶

嫩度是肉类产品的一个重要质量指标,决定肉类嫩度的主要是肌原纤维蛋白和结缔组织,其中结缔组织对嫩度的影响取决于其含量、类型及交联程度,特别是结缔组织的交联程度随动物年龄的增大,从而年老动物的肉质较年轻者韧性更大。阿部等人[1]比较了2个月的仔鸡和淘汰蛋鸡的肉质,确认淘汰蛋鸡鸡腿和鸡胸肉的硬度分别比仔鸡大29.4%和39.5%,两部位的总胶原蛋白含量分别高于仔鸡,但热溶性胶原蛋白比例却低于仔鸡。Northcuttt等人[2]指出:仔鸡鸡胸肉的Warner-Bratzler剪切力仔鸡年龄的增加而增加。徐幸莲等人[3]证实了肉鸡和淘汰蛋鸡的差别,发现淘汰蛋鸡肌肉的持水功能比肉鸡肌肉低,但剪切力显著地高。因此,淘汰蛋鸡在食用或利用之前必须进行嫩化处理。

超声波处理是肉类嫩化的一种新技术,它以两种方式作用于肉类:一是破坏肌肉细胞的完整性,二是增强酶促反应[4]。已经报导了超声波可以引起肌肉肌节的扩展[5-6]、肌原纤维的崩溃和破碎[6-8]、Z-线区域微结构的改变[6,9-10]。但未见超声波处理对肉类内源酶,特别是钙激活酶(calpain)活性影响的报导,而肉类的嫩化过程实质上是依赖于如pH、离子强度等物理化学条件的酶促反应,肌原纤维和肌原纤维相关蛋白质的水解作用通过弱化肌原纤维内和肌原纤维间的键而使肉类嫩化[11]。一系列的研究表明,钙依赖性蛋白酶对于肉类的嫩化是必不可少的[12-15]。钙激活酶催化脂原纤维的降解而使肉的嫩度增大。本研究的目的是探讨超声波嫩化过程中钙激活酶活性及鸭肉剪切力的变化,确定钙激活酶活性与鸭肉剪切力的关系,为超声波嫩化技术提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

淘汰蛋鸭(20个月龄)由徐州惠农鸭业有限公司提供。蛋鸭宰杀后,取胸肉剔除可见脂肪和结缔组织,实验前贮藏于-18℃。

Tris、β-巯基乙醇、酪蛋白、EDTA、三氯乙酸 Sigma公司产品；其余化学试剂 为国产分析纯级产品。

超声波细胞粉碎仪 BILON96-Ⅱ型,上海比朗仪器有限公司；匀浆机 ZW-800G,温州维科生物设备有限公司；台式高速冷冻离心机 德国Sigma 3-30K；分光光度计 UV-2600,日本Shimadzu公司；嫩度计:C-LM3B 东北农业大学工程学院。

1.2 实验方法

1.2.1 超声波处理 鸭胸肉解冻后,放入塑料袋中,排除空气后密封。将塑料袋放入加水的烧杯中,置于超声波细胞粉碎仪中,将超声波探头(Φ10mm)插入烧杯中,避免探头与塑料袋接触。改变超声波功率或超声波处理时间,嫩化鸭胸肉。

1.2.2 钙激活酶的提取 按照Koomaraie[16]描述的程序提取钙激活酶。简要地,用3倍体积的含20 mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA和10mmol/L 2-β-巯基乙醇、pH7.5的冰冷缓冲液将鸭肉组织用匀浆机进行匀浆处理。匀浆液在28000×g离心2 h,上清液用四层的粗棉布和玻璃棉过滤后,将pH调整到7.5,经透析平衡缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA和10mmol/L 2-β-巯基乙醇,pH7.5)透析20h。105000×g离心1h后,立刻上柱(DEAE-Sephacel,流速150mL/h)纯化。用5倍的平衡缓冲液冲洗柱子,以除去未结合的蛋白质。用含0～400mmol/L NaCl 的平衡缓冲液梯度洗脱(每批350mL)。

1.2.3 钙激活酶活性的测定 以酪蛋白作为底物测定钙激活酶的活性[16]。取反应溶液(100mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,100mmol β-巯基乙醇,0.1mmol/L EDTA,5mmol/L CaCl2,5g/mL 酪蛋白,pH7.5)3mL,加入1mL被分离的稀释后的该蛋白酶粗酶液,空白为3mL反应溶剂(100mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,100mmol β-巯基乙醇,0.1mmol/L EDTA,5mmol/L CaCl2,pH7.5),加入1mL缓冲液B(50mmol/L Tris-HCl,4mmol/L EDTA,pH7.0,1mol/L的醋酸调节)；对照组为3mL反应溶液,加入1mL变性酶液,一般用加热法,将酶液在100摄氏度沸水浴中加热5min,上述各反应的总体积均为4mL。反应在室温下进行了30min后,加入4mL的5%的TCA终止反应,TCA溶液的最终浓度为2.5%。然后将反应液离心(28000×g,30min),测定上清液的吸光值。

一个酶活性单位被定义为在标准实验条件下30℃ 30min内在280nm下的吸光度增加1.0单位所需的酶的数量。

1.2.4 剪切力的测定 取适量鸭肉在85℃加热至中心温度达到70℃并保持30min,取出迅速冷至室温,用吸水纸吸干表面水分后,用直径1cm的空心取样器顺着肌纤维方向取样,然后在嫩度计上测定其剪切力值。每个处理样测定3次,求平均值。

2 结果与分析

2.1 超声波功率对鸭肉中钙激活酶活性和肌肉剪切力的影响

不同功率的超声波功率应用于鸭肉嫩化处理的结果如图1所示。

图1 超声波功率对鸭肉剪切力 和钙激活酶活性的影响Fig.1 Effect of ultrasound powers on the shear force and calpain activity in duck meat

从图1可以看出:在300W以内的范围内,随着超声波功率的增大,鸭肉中钙激活酶活性急剧升高,而肌肉的剪切力几乎直线下降。继续增大功率至400W,酶活性下降,肌肉的剪切力变大。这一结果与李正英等人报导的超声波嫩化羊肉的研究结果[17]相似。他们发现:剪切力随超声波功率的增大而快速降低,当超声波功率达到3.0W/cm2后,继续增加超声波功率时剪切力变化不大。

2.2 超声波处理时间对鸭肉中钙激活酶活性和肌肉剪切力的影响

超声波时间对鸭肉中钙激活酶活性和肌肉剪切力的影响表现出与超声波功率相似的变化。即在5～15min范围内,钙激活酶活性急剧增大,剪切力直线下降,在15～25min范围内钙激活酶活性下降,剪切力升高。Jayasooriya等人[18]报导了在0～60s超声波处理时牛肉的剪切力有很大程度的下降,但进一步延长处理时间,剪切力无显著变化。Smith等人[19]也曾发现,超声波处理4min可增加肉类的嫩度,但处理时间延长至8～16min时肉类的嫩度反而降低。本研究的结果与上述结论基本一致。

图2 超声波处理时间对鸭肉剪切力 和钙激活酶活性的影响Fig.2 Effect of ultrasound times on the shear force and calpain activity in duck meat

2.3 鸭肉中钙激活酶活性与肌肉剪切力的相关分析

对不同超声波功率嫩化及不同超声波时间嫩化鸭肉后肌肉中钙激活酶活性和肌肉剪切力之间进行相关分析,结果见图3和图4。

图3 不同超声波功率嫩化时鸭肉剪切力 与钙激活酶活性的关系Fig.3 The relationship between duck meat shear force and calpain activity in tenderization by different ultrasound powers

图4 不同超声波处理时间嫩化时鸭肉剪切力 和钙激活酶活性的关系Fig.4 The relationship between duck meat shear force and calpain activity in tenderization by different ultrasound treating times

由图3和图4可知:超声波嫩化期间,肌肉中钙激活酶活性与肌肉的剪切力呈现负相关(R2>0.76)。即随着钙激活酶活性的增大,肌肉的剪切力存在下降的趋势。

3 讨论

3.1 鸭肉的超声波嫩化

超声波嫩化作用一方面是通过超声波空穴现象对肌肉组织产生物理损害,另一方面则是在损害或弱化肌肉组织的同时导致内源酶的激活而促进酶解作用[4]。

在较低的超声波功率(≤300W)或较短的处理时间(5～15min)范围内,随着超声波功率的增大,产生的空穴效应对肌肉组织的物理作用增强,有利于钙离子从细胞结构中释放出来,从而激活钙激活酶。Got等人[5]和Jayasooriya等人[18]均观察到超声波处理后肌肉的pH升高,并认为这是由于肌肉细胞中离子释放出的缘故。Lee等人[20]也认为用焦磷酸钠和氯化钠注射提高了pH,加速了钙激活酶的活性,从而改善了肉嫩度。Got等人[5]确认,超声波处理后,肌纤维间的空间内游离Ca2+增加30%。Koohmaraie等人[21]指出:肌原纤维小片化过程是由Ca2+调解的,当肌肉切片在用含螯合剂(EDTA或EGTA)的缓冲液处理时未观察到肌原纤维小片化指数的改变,而当在肌肉切片用含CaCl2的缓冲液处理时肌原纤维小片化指数明显加速。而当肌肉切片单独用普通缓冲液处理时,肌原纤维小片化指数的增加量远小于未处理的对照肌肉样品。他们认为这种肌原纤维小片化指数的差异可能是由于大容量的缓冲液稀释细胞内Ca2+的浓度。Pohlman等人[22]指出:超声波作用于肉类可以促进增加钙离子对钙激活酶的有效性。本实验中发现随着超声波处理的进行,肌肉中钙激活酶活性增大,从而肌肉的剪切力变小。这一结果与上述研究和发现相一致。但当进一步加大超声波处理(功率超过300W或时间大于15min)时,钙激活酶的活性下降,肌肉剪切力增大。这是因为在超声波作用的同时也会产生一定的热量[7,18]。Jayasooriya等人[18]确认超声波处理可能导致15～30℃的温度升高。这种热效应会使肌肉表面产生部分蒸煮[6]。肌肉表面的蒸煮将会导致表面蛋白质的变性,不利于Ca2+的释放,从而钙激活酶的活性减弱,肌肉硬度增大。或者,由于钙激活酶的最适温度为25℃左右[23],当温度升高后,钙激活酶的活性受到抑制。

3.2 钙激活酶活性与肉类嫩度

人们普遍认为肉的嫩化过程本质上是酶促反应并依赖于pH、离子强度等物理化学条件。肌原纤维和与肌原纤维相关蛋白质的水解通过弱化肌原纤维内和肌原纤维间的键而使肉嫩化。尽管肌肉中的内源酶包括组织蛋白酶、蛋白酶体和钙激活酶三种酶,但研究表明钙激活酶对肉类的嫩化是至关重要的[11,24]。

高桥[23]认为,动物死亡后,肌浆中的Ca2+浓度增大2000倍,此时由Ca2+直接作用导致肌原纤维和中间纤维的非酶促脆弱化而使肌肉弱化,从而提出了肉类嫩化的“非酶钙理论”。但是,许多研究都证实了酶的作用[12-15]。Pohlman等人[22]也确认:超声波作用于肉类可以促进增加Ca2+对钙激活酶的有效性。Geesink等人[25]则指出,Ca2+浓度与肌原纤维小片化指数(myofibrillar fragmentation index,MFI)显著相关,而肌肉的嫩化与肌钙蛋白-T的降解显著相关。由于肌钙蛋白-T是钙激活酶的底物,因此,其降解过程不是通过Ca2+的直接作用,而是钙激活酶作用的结果。本实验用超声波处理得出的结果也表明肌肉的嫩化与钙激活酶呈负相关(R2>0.76),支持了肉类嫩化的酶促机理。

4 结论

超声波处理可以激活鸭肉中钙激活酶活性从而降低肌肉的剪切力。最适的超声波处理条件为 300W功率、15min处理时间。

利用不同功率的超声波及不同超声波处理时间嫩化鸭肉的结果都显示出钙激活酶与肌肉剪切力之间呈现一定的负相关(R2>0.76)。

超声波处理能够激活鸭肉中的钙激活酶,对鸭肉的嫩化具有促进机理。

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Study on effect of ultrasound treatment on calpain activityof spent laying duck muscles

QIN Wei-dong,MA Li-hua,CHEN Xue-hong,WANG Jia-jun

(Food Engineering School of Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221000,China)

The effect of ultrasound tenderization of spent laying duck pectoralis muscle were studied in different powers and ultrasound treatment times. The results indicated that activity of calpain in the pectoralis muscle was increased by the ultrasound treatment and proteolysis of myofibrillar by calpain reduced the shear force of the muscle. Two important factors were the ultrasound power and ultrasound treatment time in determination of the tendered effect. The optimum conditions for ultrasound tenderization of spent laying duck pectoralis muscle were 300W of power and 15min of the treatment time,respectively. The results of correlation analysis demonstrated that there were negative correlation(R2>0.76)between activity of calpain and the shear force of the muscle.

spent laying duck;ultrasound;tenderization;calpain

2014-05-04

秦卫东(1961-)，男，本科，教授，研究方向：畜禽科学与加工。

国家富民强县项目(BN2011209)。

TS253.1

A

1002-0306(2015)03-0078-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.007