炙甘草汤对慢性病毒性心肌炎小鼠病理损伤的影响

邝志斌

炙甘草汤对慢性病毒性心肌炎小鼠病理损伤的影响

邝志斌

目的 研究炙甘草汤影响慢性病毒性心肌炎小鼠病理损伤发生的情况。方法 将60只小鼠随机分为两组, 对照组和炙甘草汤组, 每组30只, 利用HE染色法对小鼠心肌病理形态进行观察, VG染色法对小鼠心肌组织胶原形态进行观察, 同时检测了小鼠心肌组织的细胞光密度和面积。结果 炙甘草汤可以抑制小鼠发生慢性病毒性的心肌炎症反应, 并减轻了小鼠的心肌组织的胶原增生情况, 炙甘草汤组小鼠心肌细胞光密度和面积均显著高于对照组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 炙甘草汤能有效地减轻小鼠发生慢性病毒性心肌炎小鼠发生病理性损伤。

慢性病毒性心肌炎；炙甘草汤；病理损伤

慢性病毒性心肌炎这一病症严重危害到人类的健康, 目前慢性病毒性心肌炎的发病机制尚未完全明确, 临床上一般要求对症治疗为主, 但是至今仍无针对性的特效治疗方法［1］。所以, 如何防治慢性病毒性心肌炎的发生仍然是心血管内科的难点和热点课题［2］。本文通过对慢性病毒性心肌炎小鼠进行炙甘草汤治疗, 观察小鼠的心肌组织病理形态学变化, 初步探讨小鼠的慢性病毒性心肌炎可能作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验小鼠60只, 雌雄各30只,4～5周的周龄,分笼饲养, 饲养条件温度和湿度正常满足小鼠的生长条件。

实验仪器包括超薄切片机(强生上海器材有限公司, 中国)、光学显微镜(Olymapas, 日本)、MIA彩色病理图像分析系统(Motic公司, 美国)。

实验病毒柯萨奇CVB3m, 利用Hela细胞传代［3］。

实验药物与试剂有煎剂的炙甘草汤水, 由黑龙江中医药大学附属第二医院提供, 主要药物成分是阿胶、生姜、大枣、人参、桂枝、麻仁、生地、麦门冬、炙甘草等, 取炙甘草汤浸膏, 用聚酰胺和732型阳离子树脂除去阳离子和鞣质,再调pH值为7.0左右, 配制药物最终浓度为生药4 g/ml。其他药剂还包括Van Gieson染液、伊红溶液、苏木素、多聚甲醛等［4］。

1.2 方法

1.2.1 实验方法 将60只小鼠随机分为两组, 即空白对照组和炙甘草汤, 每组30只。炙甘草汤组于实验的第1、7、14、21天给予腹腔注射RMl640稀释的CVB3m, 每次注射病毒量为0.1 ml10-3TCIDS0 CVB3m, 空白对照组于相应的时间点给予同体积的RMl640。然后在在末次病毒注射后第7天开始给药灌胃, 其中对炙甘草汤组需要予炙甘草汤水煎剂灌胃, 用量为1 ml；空白对照组灌以1 ml的蒸馏水。1次/d,连续4周。

1.2.2 标本的采集与检测 将处理后的小鼠颈椎脱臼后处死, 将小鼠前胸备皮, 消毒, 开胸, 取出心脏, 于4℃条件预冷生理盐水冲洗血污, 随后用滤纸吸干, 放置固定于4%多聚甲醛溶液中。随后用HE染色法和VG染色法对小鼠的心肌组织进行染色［5］。

1.2.3 检测小鼠心肌细胞凋亡 检测方法是应用DNA原位缺口末端标记法, 首先对组织进行石蜡组织切片, 再经过常规的脱蜡脱水处理后, 用蛋白酶K(Roche, USA)在室温条件下孵育30 min后, 使用PBS缓冲液洗干净切片后, 将切片放于含有甲醇的0.3%过氧化氢溶液在室温条件下去孵育30 min,使用PBS缓冲液冲洗2次, 然后加入TUNEL反应混合液在湿盒中37℃条件下孵育60 min, 使用PBS缓冲液冲洗3次,使用苏木精复染, 梯度乙醇脱水透明, 最后使用中性树胶封片。每张石蜡切片于400倍光学显微镜下观察, 计数呈棕黄色的TLNEL阳性细胞核以及所有细胞核。心肌细胞凋亡情况以图像分析系统(Motic Images Aovancel3.2)检测的心肌细胞的平均光密度和总面积［6］。

1.3 统计学方法 采用SA.8.2 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差s)表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别小鼠心肌组织HE染色结果 对照组的30只小鼠心肌组织通过HE染色发现其纤维排列整齐, 间质血管无改变, 未见心肌细胞变性、坏死。炙甘草汤组小鼠心肌组织通过HE染色发现其纤维排列紊乱较轻教, 血管充血出血,少量炎细胞浸润, 未见心肌断裂, 间质纤维化程度较为轻微。

2.2 不同组别小鼠心肌组织VG染色结果 对照组小鼠心肌组织通过VG染色发现其组织被染成红色的极纤细的胶原纤维, 而且胶原纤维覆盖面积大。炙甘草汤组小鼠的心肌组织通过VG染色发现其组织附近有少量的胶原纤维。说明病毒感染了小鼠的心肌组织, 可以发现部分胶原结缔组织发生增生, 还发生了间质纤维化现象。通过图像分析系统计算两组的胶原容积发现炙甘草汤组的心肌胶原容积分数要高于对照组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 不同组别小鼠心肌细胞凋亡的变化 炙甘草汤组小鼠心肌细胞光密度达到0.334, 显著高于对照组的小鼠心肌光密度0.304, 差异具有统计学意义(P<0.05)；炙甘草汤组小鼠心肌细胞面积达到6.486, 显著高于对照组的小鼠心肌面积4.259, 差异具有统计学意义 (P<0.05)。见表1。

表1 不同组别小鼠心肌细胞光密度和面积的变化 (±s)

表1 不同组别小鼠心肌细胞光密度和面积的变化 (±s)

注：两组比较, P<0.05

对照组0.304±0.1144.259±0.241炙甘草汤组0.334±0.1276.486±0.589

3 讨论

根据中国的中医古籍记载, 是没有“慢性病毒恤心肌炎”这一病名的, 临床上根据其发病表现, 可归类于“痰饮”、“喘证”、“水肿”、“心悸”等病证。大多数医家的经验认为慢性病毒性心肌炎的主要发病机理为气阴两型, 所以在临床多上此病的治疗大多采用具有通阳复脉和益气养阴功效的炙甘草汤进行治疗。药方中重用生地黄滋阴养血, 麦冬、阿胶、麻仁滋心阴, 养心血, 充血脉, 配伍炙人参、甘草、大枣益心气,补脾气, 佐以桂枝, 生姜辛涵心阳, 行温通, 通血脉；诸药合用, 使阴阳调和, 气血充足, 则脉结代、心动悸, 皆得其平［7］。

在收到病毒感染后1个月的小鼠心肌病理改变显示有不同程度的炎性病变, 病变部位炎症细胞浸润, 最终导致心肌细胞坏死。本研究中, 而与对照组相比, 炙甘草汤组的病理形态学通过HE染色法和VG染色法均观察到心肌组织的病理变化较轻, 炙甘草汤组小鼠心肌细胞光密度和面积均显著高于对照组。

综上所述, 炙甘草汤能有效地防治慢性病毒性心肌炎,但是具体的防治作用机制尚有待于下一步工作的继续研究。

［1］ 王丽慧.病毒性心肌炎的中医药治疗进展.云南中医中药杂志,2012,33(9):76-78.

［2］ 黎萍, 刘晓燕.病毒性心肌炎发病机制及辅助检查研究进展.心血管病学展,2012,3(4):515-517.

［3］ 寇秀静, 叶鸿瑁, 吴相攸.病毒性心肌炎患儿细胞免疫状况的研究.中华儿科杂志,2000,38(2):76.

［4］ 郝梓旭, 王中男.病毒性心肌炎的现代治疗手段研究近况.吉林中医药,2007,27(5):66-67.

［5］ 王驰.炙甘草汤加味治疗室性早搏40 例.浙江中医杂志,1999,34(2):62.

［6］ 刘玉秀, 姚晨, 陈峰, 等.非劣效性/等效性试验中的统计学分析. 中国临床药理学杂志,2000,16(6):448-452.

［7］ 陈会君, 田源, 胡妮娜.炙甘草汤对慢性病毒性心肌炎小鼠心肌组织ADAMTS-1 的影响.中国保健营养(旬刊),2012(z2).596-598.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.11.183

2015-02-06］

519100 遵义医学院第五附属(珠海)医院心血管内科