高氨氮污水的微生物修复初探

吴酬飞，谢运昌，王 芬

(1.湖州师范学院生命科学学院，浙江 湖州 313000;2.中国科学院南海海洋研究所，广东 广州 510275)

水体中的氨氮(NH4—N)污染日趋严重，造成水中鱼虾的中毒死亡［1］.高含量NH4—N经微生物作用后可转变成硝氮(NO3—N)，而NO3—N又极易被还原成NH4—N或亚硝氮(NO2—N)，从而造成水体富营养化，进而使水中藻类及其他浮游生物大量繁殖，严重时会使水中溶解氧下降并释放毒素，造成水生生物中毒或者缺氧死亡，从而影响污染水体的生态平衡，使生物多样性遭到破坏［2－3］.人们运用物理修复和化学修复技术进行海水养殖废水的修复治理，但是由于物理与化学方法具有能源消耗大、工艺难控制、容易引发二次污染等不利因素，进而效果不尽如人意［4］.在这一形势下，发展有效的修复方法降低水中的NH4—N含量显得尤为重要.

生物修复通过细菌、真菌甚至高等植物以及细胞游离酶的自然代谢过程降解、去除环境中的污染物，具有着低耗、高效和环境安全等优势［5－7］.广义来讲，生物修复主要有微生物修复、植物修复和细胞游离酶生物修复等.目前，生物修复已成为一个富有挑战性的前沿领域，并且研究已进入一个相当活跃的时期.学者们比较倾向于采用生物修复中的微生物修复.而微生物修复技术，是利用天然存在的或经培养所得的功能微生物群，因为具备某种生物特性，因此在适宜环境条件下，可促进或强化微生物代谢功能，同时还能降低有毒污染物活性或降解成无毒物质［8－9］.

本研究从高密度养殖水体中筛选NH4-N降解微生物，对其进行分子鉴定和降解途径初步分析.在此基础上，进一步将微生物接种至高氨氮污水，进行实际应用研究，为NH4-N污水的微生物处置技术开发奠定物质基础.

1 材料与方法

1.1 NH4—N降解菌的富集培养

取高密度养殖水体50 g，接入装有100 mL富集培养基［葡萄糖 5.0 g，(NH4)2SO42.0 g，NaCl 2.0 g，FeSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO41.0 g，pH 值7.2 ～7.4，MgSO4·7H2O 0.5 g，水 1000 mL］的500 mL三角瓶中，于120 rpm，28℃下摇床培养7 d，且每隔1 d向培养基中加入5%的(NH4)2SO4溶液1 mL，以淘汰不能利用NH+4的微生物.随后，从第一次富集培养基中取出1 mL上清菌液，加到新鲜富集培养基中，进行第二轮富集培养.

1.2 NH4—N降解菌的分离培养

取富集培养基中的上清菌液1 mL，采用十倍稀释法用无菌水将菌液分别稀释成 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9倍原菌液浓度，吸取稀释菌液1 mL，在分离培养基［葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO42.0 g，NaCl 2.0 g，FeSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO41.0 g，pH 值 7.2 ～7.4，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1000 mL，2% 琼脂］上涂布平板，置 28℃恒温培养箱中培养，观察NH4—N降解菌的生长情况.挑取平板上长出的单菌落进行重复分离纯化培养，直到得到单菌株的纯培养.

1.3 NH4—N 含量的测定

目前，针对NH4—N含量测定，已有多种成熟有效的方法.但是，考虑到减少环境污染和降低成本，因此排除了《纳氏试剂分光光度法》(HJ 535－2009)与《蒸馏－中和滴定法》(HJ 537－2009)，采用了同样方法成熟的国标法《水杨酸分光光度法》(HJ 536－2009).水杨酸分光光度法是一种测量饮用水、大部分原水和废水中铵的方法.其原理是:在亚硝基铁氰化钠［Na2Fe(CN)5NO·2H2O］存在下，铵与水杨酸［C6H4(OH)COOH］和次氯酸钠(NaClO)反应生成蓝色化合物，在697 nm处用分光光度法加以测定.同时，在pH值为11.7且有亚硝基五氰络铁酸钠存在时，铵与水杨酸也要发生反应，从而样品中所有的铵都定量地被测定.加酒石酸钾钠可掩蔽阳离子，特别是钙镁离子的干扰.这种方法的最低检出浓度为0.01 mg/L，NH4—N检测上限浓度可达1 mg/L.

1.4 NO3—N及NO2—N含量的测定

为了了解细菌是否将NH4—N转化为NO3—N或NO2—N，作者又将氨氮降解菌接种至相同的培养基中进行培养.

NO3—N含量的测定，采用的是国标法《水质硝酸盐氮的测定 紫外分光光度法》(HJ/T 346－2007)测定NO3—N，该方法利用硝酸根离子(NO－3)在220 nm波长处的吸收而定量测定NO3—N.溶解的有机物在220 nm处也会有吸收，而NO－3在275 nm处没有吸收.因此，在275 nm处作另一次测量，以校正NO3—N值.

NO2—N含量的测定，采用的是经典国标法《水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法》(GB 7493－87)测定NO2—N.该方法的原理是，在磷酸介质中，pH值为1.8时，试样中的亚硝酸根离子(NO－2)与4－氨基苯磺酰胺(C6H8N2O2S)反应生成重氮盐，它再与 N—1—萘基—乙二胺二盐酸盐(C12H14N2·2HCl)偶联生成红色染料，在540 nm波长处测定吸光度.

1.5 细菌基因组DNA提取和纯化

从平板培养基的菌落中刮取少许样品，并加入3 mL PBS缓冲液;经3次润洗后，将样品转移至10 mL离心管中;于4℃下13000 g离心5 min后，弃上清;加入500 mg玻璃珠和1 mL Buffer SLX Mlus，涡旋10 min，使细胞充分裂解.按美国Omega公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒操作步骤进行提取和纯化.

1.6 16S rDNA PCR 扩增

以提取的DNA为模板，进行16S rDNA PCR扩增实验.PCR 反应体系(50 μL):1 μL DNA 模板，1 μL dNTP，2 μL 引 物 1(27f)，2 μL 引 物 2(1492r)，1 μL Super Taq DNA 酶(2.5 U/μL)，5 μL 10 × HG PCR buffer，38 μL ddH2O.PCR 反应条件:95℃预变性，5 min，1 个循环;94℃变性30 s，55℃梯度温度退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环;最后72℃延伸10 min.

1.7 测序鉴定

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切割获得目标DNA片段，送往上海生工测序，并进行NCBI网上比对分析.

2 结果与分析

2.1 NH4—N降解菌的分离

通过14 d的富集培养，1 d的分离培养，在高密度养殖废水中筛选出3株NH4—N降解菌，命名为GYW1，GYW2和GYW3.三种微生物菌株形态(见图1).

图1 GYW1，GYW2和 GYW3三种NH4—N降解菌的平板和摇瓶培养

2.2 NH4—N降解菌的分子鉴定

以提取的三种细菌基因组DNA为模板，分别进行16S rDNA PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖电泳，结果(见图2)，从各菌株基因组DNA中均能扩出一条约1400 bp片段，与设计扩增的序列长度一致.

将测序所得到的16S rDNA的序列与NCBI数据进行系统对比.比对结果列于表1.从表1看出，GYW1序列与伯克霍德菌(Burkholderia cepacia)16S rDNA序列的相似度为99%，因而鉴定为伯克霍德菌;GYW2和GYW3与阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii/Enterobacter Sakazakii)16S rDNA序列的相似度均为99%，因而鉴定为阪崎肠杆菌.

图2 三种细菌的琼脂糖凝胶电泳图谱

表1 经琼脂糖凝胶电泳获得的16S rDNA序列

2.3 NH4—N降解途径分析

对不同NH4—N降解时间的培养液中的NO3—N和NO2—N浓度进行测定分析，结果见表2.由表可见，随着时间的延长，三种微生物的NH4—N降解液中NO3—N和NO2—N含量均有所升高，且同一时间，相同的降解液中NO2—N远高于NO3—N的浓度，表明三种微生物均先将 NH4—N转化为NO2—N，再进一步氧化为 NO3—N.GYW1、GYW2和GYW3三种微生物的16 h NO2—N的浓度分别为:0.3079 mg/L、13.4027 mg/L 和7.0783 mg/L;NO3—N生成量的浓度仅分别为:0.0178 mg/L、1.1596 mg/L和 0.4391 mg/L;同时在 16 h时，GYW1、GYW2和 GYW3三种微生物消耗 NH4—N的浓度分别是:46.718 mg/L、38.803 mg/L 和35.556 mg/L.由此得出，在 NH4—N 降解 16 h时，GYW1将NH4—N转化为NO2—N和NO3—N的转化率分别为0.66%和0.04%，表明 GYW1可在新陈代谢中将NH4—N直接转化为促进其生长的蛋白质、酶等物质，仅产生极其微量的NO2—N和NO3—N，并不会对环境造成二次污染.GYW2的NO2—N和NO3—N的转化率分别为34.54%和2.98%，GYW3的NO2—N和NO3—N的转化率分别为19.91%和1.23%，表明GYW2和GYW3在NH4—N降解过程中，会通过新陈代谢作用生成可致癌的NO2—N 和 NO3—N，且 NO3—N 的生成滞后于NO2—N.因此，GYW2和 GYW3虽具有较强的NH4—N降解能力，但并不适合NH4—N废水的实际修复应用.

表2 NH4—N降解过程中生成NO3—N和NO2—N的含量

2.4 实际应用研究

将菌液OD值均为0.1的GYW1接种到NH4—N初始浓度为1250 mg/L的污水中，通过观察生长曲线发现，GYW1的适应期为4 h左右，16 h时达到生长稳定期，且该菌生长速度较快(见图3).在NH4—N降解能力方面，该菌能在48 h内将初培养基中始浓度为 1250 mg/L的 NH4—N降低至126.09 mg/L，降解率高达 89.91%(见图 4)，意味着该菌在高氨氮污水生物修复具有较大的应用潜力.

图3 GYW1生长曲线图

图4 GYW1的NH4—N降解曲线图

3 结论与讨论

综合以上研究，GYW1、GYW2和GYW3在不同浓度NH4—N培养基中，均表现出具有很强的生长能力与NH4—N降解能力.GYW1经16S rDNA鉴定为伯克霍德菌;GYW2和GYW3为阪崎肠杆菌.

伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌.美国的植物病理学家Burkholder首次发现它可以引起洋葱茎腐烂，称为洋葱假单胞菌［10－12］.Yabuuchi et al.［13］正式将该菌及其它 6 个属于rRNA群的假单胞菌归为一个新属，即伯克霍尔德菌属.伯克霍尔德氏菌是由一些在16S rDNA序列相似度大于97.5%的种所构成的群体.目前发现的伯克霍尔德氏菌有17种，分别是:洋葱伯克霍尔德氏菌(B.Cepacia)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.multivorans)、椰毒伯克霍尔德氏菌(B.Cenocepacia)、越南伯克霍尔德氏菌(B.vietnamiensis)、吡咯伯克霍尔德氏菌(B.Pyrrocinia)、B.stabilis、B.dolosa、B.ambifaria、B.anthina、B.ubomensis、B.latens、B.diffusa、B.arboris、B.seminalis、B.metallica、B.contaminans和 B.lata［14－15］.这类菌对营养要求不高，可利用95～105种不同有机物作为碳源，大多数的培养环境下均可生长.伯克霍尔德氏菌具有生物防治、促进植物生长以及生物修复等功能.它可以产生多种具有抗菌活性的代谢产物，如铁载体、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱等［16－18］.在20世纪80年代，BCC曾作为生物杀虫剂和生物杀菌剂在国外广泛使用，如 Type wisconsin、Deny、Blue circle等.目前，国内外已将其已应用于生物防治，分解有毒物质等领域.而此次试验，首次发现伯克霍尔德菌中的某些细菌(比如GYW1)还具有较强的NH4—N降解能力.

阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii)是肠杆菌科的一种.阪崎肠杆菌能引起新生儿脑膜炎、小肠结肠炎以及茵血症等［19］.目前，尚没有其生物修复相关报道，而本实验首次发现阪崎肠杆菌的某些细菌具有NH4—N降解能力.

然而，GYW2和 GYW3在降解 NH4—N的同时，其代谢过程会生成NO2—N和NO3—N，产生二次污染，可见这两种细菌并不适合NH4—N废水的实际修复应用.GYW1在降解NH4—N的同时，仅代谢产生极微量的NO2—N和NO3—N，分析其原因可能是在代谢途中细菌将NH4—N直接转化为生长所需的蛋白质、酶等营养物质.因此在有氧条件下，GYW1降解NH4—N作用并不会带来二次污染，且该菌能在48 h内将初培养基中始浓度为1250 mg/L的NH4—N降低至126.09 mg/L，降解率高达89.91%，可见该菌在高氨氮污水生物修复具有较大的应用潜力.

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