Rapamycin增强上皮性卵巢癌细胞株对顺铂的敏感性研究

张海燕，孙 红

Rapamycin增强上皮性卵巢癌细胞株对顺铂的敏感性研究

张海燕，孙 红*

目的 比较单独mTOR抑制剂Rapamycin、单独顺铂或联合2种制剂对上皮性卵巢癌SKOV3、ES-2细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用Western blot检测Rapamycin对mTOR的抑制效应，检测顺铂对mTOR信号通路的影响度。采用单独Rapamycin、单独顺铂或联合2种制剂作用于上皮性卵巢癌SKOV3和ES-2细胞，运用MTT和FCM比较不同治疗方案对其增殖和凋亡的影响。结果 在正常培养条件下，100 nmol/L Rapamycin作用24 h，上皮性卵巢癌细胞内p-mTOR表达显著抑制；顺铂可影响上皮性卵巢癌ES-2细胞mTOR信号通路的激活情况；与单独顺铂作用和单独Rapamycin作用比较，联合两种制剂显著增加SKOV3和ES-2细胞的早期凋亡率，抑制细胞增殖(P均<0.05)。结论 mTOR信号通路在上皮性卵巢癌顺铂化疗中发挥调节作用，Rapamycin可通过抑制mTOR激活而增强顺铂的杀伤作用。

上皮性卵巢癌；mTOR；Rapamycin；顺铂

0 引言

卵巢癌(Ovarian cancer，OC)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，病死率位居妇科恶性肿瘤首位。化疗在卵巢癌治疗中占据着重要的地位。以铂类为基础的联合治疗为上皮性卵巢癌的一线化疗方案，但铂类药物的毒副反应以及抗药性问题越来越突出，成为治疗的瓶颈。PI3K/AKT/mTOR信号通路在上皮性卵巢癌的发生、发展以及化疗耐药方面发挥着重要作用。本文拟采用顺铂作用于上皮性卵巢癌SKOV3、ES-2细胞，观察不同时间、不同浓度作用下，mTOR信号通路激活情况；比较单独抑制剂(Rapamycin)、单独顺铂以及联合2种制剂的治疗方案对SKOV3、ES-2细胞的增殖及凋亡的影响，观察Rapamycin对顺铂抗肿瘤效应的影响，为筛选有效的化疗方案提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3、ES-2细胞均购自ATCC。将SKOV3、ES-2细胞按照106/mL密度接种于100 mL的培养瓶中，用含10% FBS、1%链青霉素的DMEM高糖培养液，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，每2天换液，细胞生长至80%～90%，胰酶消化、传代。取对数生长期细胞用于实验。

1.2 主要试剂 兔抗人磷酸化mTOR单克隆抗体、兔抗人mTOR抗体、兔、鼠抗人GAPDH单克隆抗体、Rapamycin均购自美国Cell Signal公司。MTT、AnnexV-PI凋亡试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.3 Western blot检测p-mTOR表达 收集施加不同处理因素的细胞5×106个，4 ℃ PBS洗涤2次，加入RIPA 100 μL，蛋白酶抑制剂1 μL，冰上裂解30 min，以12 000 r/min速度在4 ℃离心30 min；95 ℃变性5 min，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，270 mA半干湿转膜90 min(Bio-Rad)；5%脱脂奶粉封闭1 h；加入一抗(mTOR1∶1 000、p-mTOR 1∶800)4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，每次15 min；加入荧光二抗(1∶3 000)37 ℃孵育1 h，PBST洗膜3次，每次15 min；Odessey检测、拍照和分析。

1.4 MTT法检测细胞抑制率 根据Western blot结果，配置药物浓度；细胞接种96孔板，分4组：①阴性对照组，即加入无药物的培养液；②阳性对照组，即加入含有DMSO不含药物的培养基；③空白对照组，即无细胞只加不含药物的培养液；④Rapamycin实验组，即加入含有0.001、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L不同浓度的Rapamycin的培养液。每个浓度设置3个平行孔；细胞培养48 h后，弃去上清，加入200 μL DMSO,充分溶解后，放置酶标仪OD450，读出结果并分析。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 根据MTT和Western blot结果，选择作用浓度。细胞接种6孔板，分3组：①单独顺铂(20 μmol/L)组；②单独抑制剂Rapamycin(0.1 μmol/L)组；③顺铂(20 μmol/L)联合Rapamycin(0.1 μmol/L)组。加药处理24 h后，常规消化收集细胞，Annexin V-PI双染色，流式细胞仪分析。每种条件做3个平行孔，并重复3次。细胞培养48 h后，弃去上清，胰酶消化、PBS洗涤后，按照凋亡试剂盒步骤进行固定，染色，上机检测。

2 结果

2.1 顺铂诱导上皮性卵巢癌ES-2细胞中AKT磷酸化 顺铂以20 μmol/L加入上皮性卵巢癌ES-2细胞上清液中(原上清液中含5%FBS)，结果显示：作用5 min后，p-AKT表达明显增加，30 min最显著，随后至120 min时略下降并持续在一定水平。见图1-A。将不同浓度顺铂加入上皮性卵巢癌ES-2细胞上清液中(原上清液中含5% FBS)，结果显示：暴露120 min后，20 μmol/L可显著增加p-AKT表达，但随着浓度增加，p-AKT表达略呈下降趋势。见图1-B。

2.2 顺铂诱导ES-2细胞内mTOR磷酸化 顺铂以20 μmol/L浓度加入上皮性卵巢癌ES-2细胞上清液中(原上清液中含5% FBS)，结果显示：作用15 min后，p-mTOR表达明显增加，30 min最显著，随后至120 min时略下降并持续在一定水平。见图2-A。将不同浓度顺铂加入上皮性卵巢癌ES-2细胞上清液中(原上清液中含5% FBS)，结果显示：暴露120 min后，20 μmol/L可显著增加p-mTOR表达，但随着浓度增加，p-mTOR表达略呈下降趋势。见图2-B。

2.3 Rapamycin抑制SKOV3、ES-2细胞中p-mTOR表达 上皮性卵巢癌SKOV3和ES-2细胞接受Rapamycin作用24 h后，采用IGF-1 50 ng/mL继续刺激30 min，Western blot检测发现Rapamycin 0.1 μmol/L显著抑制p-mTOR表达，参照对照组，活性分别下降了83.7%、87.2%，见图3。

图1 Western blot检测不同浓度的顺铂作用ES-2细胞不同时间，p-AKT表达水平的变化

图2 Western blot检测不同浓度的顺铂作用ES-2细胞不同时间，p-mTOR表达水平的变化

图3 Western blot检测Rapamycin抑制卵巢癌SKOV3、ES-2细胞中p-mTOR表达

2.4 Rapamycin抑制SKOV3、ES-2细胞增殖 采用不同浓度梯度Rapamycin作用细胞，MTT结果提示，Rapamycin抑制SKOV3、ES-2细胞生长，呈浓度依赖性，但其抑制作用相对于Triciribine较弱。见图4。

图4 MTT检测Rapamycin对上皮性卵巢癌SKOV3、ES-2细胞生长抑制情况

2.5 Rapamycin联合顺铂显著促进上皮性卵巢癌SKOV3、ES-2细胞凋亡 流式细胞仪分别检测单独Rapamycin 100 nmol/L。单独顺铂20 μmol/L以及两者联合作用对SKOV3、ES-2细胞凋亡率的影响。结果显示，细胞接受不同因素处理24 h后，联合用药组对两种细胞的凋亡率均显著高于单独顺铂组以及单独Rapamycin组(P<0.01)。见图5。

图5 流式细胞仪检测SKOV3、ES-2细胞凋亡率

3 讨论

PI3K/AKT信号通路是细胞生存和抗凋亡的重要传导通路之一，并且与肿瘤的化疗耐受关系密切。Kim等[1]报道，紫杉醇可通过下调PI3K活性，使AKT失活，从而促使细胞凋亡。Abdul等[2]发现，蒽环类抗菌药物(Anthracycline)能够提高PI3K活性，继而激活PI3K下游蛋白AKT，从而活化NF-κB，抑制细胞凋亡。Li等[3]研究认为，阿霉素可增加磷酸化AKT及其下游底物GSK-3β、FOXO3α和Bim表达，但大剂量阿霉素也可抑制PI3K/AKT信号通路的激活，从而促进细胞凋亡。Martelli等[4]研究发现，依托泊苷可激活AKT/NF-κB而延迟细胞凋亡时间，PI3K激酶抑制剂LY294002则可显著降低癌细胞对依托泊苷的抗性，从而提高细胞对药物的敏感性。因此，寻找化疗激发的细胞自我保护机制，因势诱导是克服化疗耐药的根本之道。

目前有关铂类化合物对PI3K/AKT信号通路的影响的研究结论存在分歧。Westfall等[5]及Zhang等[6]均报道，卡铂可激活卵巢癌细胞株PI3K信号通路，PI3K抑制剂LY294002可以阻断此现象，从而增强癌细胞对卡铂的敏感性。Weir等[7]研究发现，姜黄素通过调节卵巢癌耐药细胞株中AKT和p38-MAPK信号转导，促进细胞G2/M期停滞，逆转对顺铂的耐受。Lee等[8]研究发现，顺铂通过抑制卵巢癌OVCAR3细胞中AKT磷酸化，促进细胞凋亡。本研究结果显示，20 μmol/L顺铂刺激5 min，上皮性卵巢癌ES-2细胞中p-AKT表达增加，30 min最显著，随后至120 min时略下降并持续在一定水平。采用不同作用浓度的顺铂作用ES-2细胞120 min，结果显示，顺铂20 μmol/L可显著增加p-AKT表达，但随着浓度增加，p-AKT表达略呈下降趋势，这与卡铂研究结果相似。本研究结果显示：20 μmol/L顺铂刺激15 min，ES-2细胞中p-mTOR表达明显增加，30 min最显著，随后至120 min时略下降并持续在一定水平；不同浓度的顺铂作用于ES-2细胞120 min，20 μmol/L可显著增加p-mTOR表达，但随着浓度增加，p-mTOR表达略呈下降趋势。由此可见，顺铂诱导卵巢上皮性癌ES-2细胞中PI3K/AKT信号通路下游靶位mTOR激活，发挥着IGF-1样作用。

雷帕霉素(Rapamycin)是一种大环内酯类免疫抑制抗菌药物，能选择性地与胞浆中广泛存在的FK506结合蛋白(FKBP)高亲和力特异性结合，形成Rapamycin-FKBP复合物，该复合物能与胞浆中mTOR蛋白高亲和力特异性结合，强烈抑制mTOR激酶活性，使之对下游底物的磷酸化调节作用减弱或消失，阻断各种生长因子转导的信号下传[9]。本文结果表明，Rapamycin对SKOV3、ES-2细胞生长抑制的强度明显低于顺铂，但Rapamycin可显著增强顺铂促进SKOV3、ES-2细胞凋亡的效应，从而增加细胞对顺铂化疗的敏感性。目前研究显示，mTOR激酶抑制剂对多种恶性肿瘤细胞有明显抑制作用[10-11]，NVP-BEZ235作为PI3K/mTOR双重激酶抑制剂，可明显抑制上皮性透明性细胞癌的增殖[12]，无疑是很有前景的抗肿瘤药物，同时也预示着在卵巢癌化疗中，合理利用信号通路激酶抑制剂，将有利于增强化疗效果，可望成为预防和逆转耐药的有效途径。

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Enhanced effects of rapamycin on cisplatin-based chemotherapy in epithelial ovarian cancer cells

ZHANG Hai-yan,SUN Hong*

(Hospital of Obstetrics and Gynecology,Affiliated to Fudan University,Shanghai 200011,China)

Objective To explore the effects of rapamycin or rapamycin combined with cisplatin on cell proliferation and apoptosis in SKOV3 and ES-2 cells.Methods Western blot was used to detect the inhibiting effect of rapamycin on mTOR and the optical concerntration of rapamycin in SKOV3 and ES-2 cells.Methyl thiazolyl tetrazolium and flow cytometry were used to detect the growth rate and early apoptosis rate after cisplatin-based chemotherapy,rapamycin treatment or combination treatment,respectively.Results The activation of mTOR was dramatically inhibited after exposuring to 100 nmol/L rapamycin under normal culture condition(P<0.05).Cisplatin could affect the activation of mTOR signaling pathway of ES-2 cells in epithelial ovarian cancer.Compared with single use of cisplatin and rapamycin,the combination use of the two agents could significantly enhance the early apoptosis rate of SKOV3 and ES-2 cells,and inhibit the proliferation of them (P<0.05).Conclusion mTOR signaling pathway could regulate the cisplatin-based chemotherapy in epithelial ovarian cancer,rapamycin could enhance the killing effect of cisplatin by inhibiting the activation of mTOR.

Epithelial ovarian cancer;mTOR signaling;Rapamycin;Cisplatin

2014-08-29

复旦大学附属妇产科医院,上海 200011

国家自然科学基金(81001150)；高等院校教育部博士点基金(20100071120090)；上海科委医学引导项目(10411960800)

10.14053/j.cnki.ppcr.201501002

*通信作者