去甲斑蝥素对非小细胞肺癌模型小鼠免疫功能的影响

付盈盈，李 林，章 激，张文静，司应明*

去甲斑蝥素对非小细胞肺癌模型小鼠免疫功能的影响

付盈盈1，李 林1，章 激2，张文静2，司应明1*

目的 研究去甲斑蝥素体内对非小细胞肺癌3LL模型小鼠免疫功能的调节作用。方法 常规培养3LL细胞，接种于ICR小鼠，将荷瘤小鼠随机分为5组，阴性对照组，5-fu阳性对照组以及NCTD 3个剂量组，另设空白对照组。腹腔注射给药2周后，取血检测血常规以及血清TNF-α和IFN-γ含量；处死小鼠，分别剥取瘤块、脾脏和胸腺，称重并计算抑瘤率和脏器指数；取脾脏，制备脾淋巴细胞并测淋巴细胞增殖情况。结果 NCTD体内可抑制3LL模型小鼠肿瘤的生长；增加荷瘤小鼠白细胞总数；上调TNF-α和IFN-γ水平；降低脾脏指数和胸腺指数；促进T、B淋巴细胞增殖。结论 NCTD体内可调节非小细胞肺癌3LL模型小鼠的免疫功能。

去甲斑蝥素；3LL；小鼠；TNF-α；IFN-γ

0 引言

肺癌发生于支气管粘膜上皮，属于全球范围内的高发性疾病，其发病率在男性恶性肿瘤中已占据首位[1]，女性的发病率也逐渐增高。现代医学治疗肿瘤疾病的技术已突飞猛进，但是即使使用先进的分子靶向治疗，非小细胞肺癌患者的生存期也仅有所延长，而生活质量依然没有得到明显的改善[2]。中药治疗恶性肿瘤，通过扶正除邪，增强荷瘤机体的免疫功能，除了抑制肿瘤生长外，还能减轻放疗、化疗引起的胃肠道反应、骨髓抑制等不良反应，减轻患者痛苦，提高生活质量，抗肿瘤效果较好[3]。斑蝥素是从动物中提取的抗肿瘤中药，广泛应用于临床，但因其有泌尿系不良反应和胃肠道反应而使其使用受到限制。为此我国又研制合成了斑蝥素衍生物，即去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)，将原分子上1、2位的2个甲基去除得到，其抗肿瘤作用没有改变，但不良反应明显降低[4]。去甲斑蝥素在选择性抑制肿瘤细胞生长的同时，可以保护正常细胞，已有研究证明，其对白细胞总数具有明显的上调作用，还可调节机体的免疫功能等[5]，与放疗、化疗联合使用，在辅助抗肿瘤的同时，还减轻了放、化疗引起的骨髓抑制等不良反应，在肿瘤治疗中有着很好的应用前景。本研究观察NCTD体内对非小细胞肺癌3LL模型小鼠肿瘤的抑制作用，探讨其对机体免疫功能的影响，考察其抗肺癌的作用机制，为NCTD治疗非小细胞肺癌的临床用药提供理论依据。

1 材料

1.1 瘤株与动物 非小细胞肺癌系肿瘤3LL细胞由华中科技大学同济药学院馈赠。ICR小鼠，SPF级，体重18～20 g，雌雄兼用，购于襄阳医学院动物实验中心，合格证号：襄医动字第2001001号。

1.2 试剂与仪器 RPMI 1640培养基(Gbico公司)；刀豆蛋白A和MTT(Sigma公司)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司，批号：1121030)；定量检测TNF-α和IFN-γ酶联免疫试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；雅培血细胞分析仪(美国雅培-1700)；电子天平AY-120(日本岛津)；ELx800型酶联免疫检测仪(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；分析天平(江苏翔宇电子有限公司)。其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 细胞培养 按常规将非小细胞肺癌系肿瘤3LL细胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在37 ℃、5% CO2孵箱中培养，生长至对数生长期时，收集肿瘤细胞，将浓度调整为1×107/mL的单细胞悬液用于实验研究。

2.2 制造模型，分组及给药 取ICR小鼠，将每只小鼠右前腋皮下注射“2.1”项中配好的3LL细胞悬液0.2 mL，待至瘤后随机分为5组：荷瘤对照组、阳性对照组及NCTD高、中、低三个剂量组，每组10只，另设正常对照组。正常对照组和荷瘤对照组灌胃生理盐水；阳性对照组以30 mg/kg剂量腹腔注射5-Fu；NCTD三个浓度组分别按15、30、60 mg/kg剂量腹腔注射给药，每周给药4次，连续用药2周，用药期间观察小鼠的活动量和一般状况。

2.3 检测小鼠血常规 停药后次日，将各组小鼠摘眼球取血，EDTA抗凝，应用血细胞分析仪检测血常规中白细胞(WBC)总数，以及淋巴细胞(LY)、中性粒细胞(NEUT)、单核细胞(MONO)、嗜酸性粒细胞(EO)和嗜碱性粒细胞(BASO)百分比。

2.4 小鼠血清TNF-α和IFN-γ含量测定 将“2.3”项所取的血液静置后离心(3 000 r/min，10 min)，取血浆，用ELISA检测试剂盒测定血清中TNF-α、IFN-γ的含量，按试剂盒说明书进行操作。在酶标测试仪上测定各样本492 nm处吸光度值。分别绘制标准曲线，计算出血清中各细胞因子的含量。

2.5 检测抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数 取血后颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下将瘤组织、脾脏和胸腺分别剥离出，分析天平称重。比较各给药组与对照组瘤重、脾脏质量和胸腺质量的差异，并按照公式：抑瘤率(%)=[1-(给药组平均瘤重/荷瘤对照组平均瘤重)]×100%；脾脏指数=脾脏质量(mg)/小鼠体重(g)；胸腺指数=胸腺质量(mg)/小鼠体重(g)，分别计算抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数。

2.6 脾淋巴细胞增殖实验 将“2.3”项中无菌条件下分离出的小鼠脾脏，按常规方法制成脾淋巴细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞数为1×107/mL。并分别向脾细胞中加入ConA或LPS，接种于96孔培养板各孔中，另分别设只含有ConA或LPS的对照孔。将培养板置于5% CO2、37 ℃饱和湿度的孵箱中培养48 h，采用MTT法检测各孔活细胞总数的情况，酶标仪于570 nm处测定各孔的OD值。

3 结果

3.1 对荷瘤小鼠血常规的影响 结果显示，模型组小鼠WBC总数明显降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，各细胞百分比例失调。与模型组相比，NCTD三个剂量组WBC总数均明显增多(P<0.05)，具有剂量依赖性，但仍少于正常对照组；NCTD各组NEUT、LY、MONO、EO和BASO绝对数(总数×比例)逐渐接近正常对照组。结果见表1。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

3.2 对荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量的作用 实验结果显示，模型组小鼠的TNF-α和IFN-γ含量与对照组相比均明显降低(P<0.01)；30 mg/kg的5-Fu腹腔注射给药后显著提高荷瘤小鼠TNF-α含量，降低IFN-γ含量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；NCTD三个剂量均能提高荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 NCTD对荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量的影响(n=10)

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

3.3 对荷瘤小鼠瘤质量的影响 实验结果显示，给药2周后，30 mg/kg剂量的5-Fu腹腔注射给药可明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤的生长，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.001)；NCTD三个剂量组(15、30、60 mg/kg)腹腔注射给药对荷瘤小鼠瘤块的生长皆有一定的抑制作用，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，且具有剂量依赖性。见表3。

表3 NCTD对荷瘤小鼠瘤质量的影响(n=10)

注：与模型组比较，##P<0.01

3.4 对荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响 实验结果显示，荷瘤小鼠脾脏指数及胸腺指数皆增加，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，5-Fu对脾脏指数及胸腺指数影响均较小(P>0.05)，而NCTD三个剂量均能降低荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，但仅有高剂量NCTD组的脾脏指数与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 NCTD对荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响(n=10)

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

3.5 对荷瘤小鼠脾T、B淋巴细胞增殖的影响 本实验OD值的大小可以反映小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖情况。实验结果显示，荷瘤小鼠T、B淋巴细胞的OD值明显减少，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；5-Fu(30 mg/kg)腹腔注射给药使T、B淋巴细胞的OD值更低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。NCTD体内给药皆可显著增加荷瘤小鼠的T、B淋巴细胞的OD值，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 NCTD对荷瘤小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

4 讨论

肿瘤的发生和发展过程是多种因素、多种机制共同作用的结果，机体的免疫功能是其中的一个因素。当机体免疫功能受到损害时，肿瘤细胞产生的免疫抑制因素以及免疫逃逸等作用均可导致肿瘤的发生和发展；而当机体发生肿瘤以后，机体的免疫系统又可通过多种方式和多种细胞因子作用于肿瘤细胞，并将其清除，从而达到抑制肿瘤生长的作用[6-7]。因此，通过提高机体的免疫功能可能达到抗肿瘤的效果，而机体的免疫功能又与多种机制有关。

外周白细胞为血液中重要的免疫细胞，可以帮助身体抵抗疾病以及外来物，在机体发生炎症或其他疾病时，血液内的白细胞总数或细胞分类百分比会产生变化[8]。脾脏和胸腺都是机体重要的免疫器官，由脾脏产生的T淋巴细胞和B淋巴细胞分别介导的细胞免疫和体液免疫在机体抗肿瘤防御中共同发挥重要作用[9]。本研究结果显示，以15、30、60 mg/kg的剂量分别给小鼠腹腔注射NCTD，在抑制肺癌模型小鼠肿瘤生长的同时，可显著升高该小鼠的白细胞总数；同时调节荷瘤机体免疫器官的生长；还明显促进由ConA和LPS分别诱导的肺癌模型小鼠T、B淋巴细胞增殖，从而证明NCTD对小鼠的免疫功能具有明显的促进作用。

TNF-α是由免疫细胞分泌的细胞因子，对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用，并能诱导肿瘤退行性变化。除了单核-巨噬细胞以外，其他如淋巴细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等也可以分泌TNF-α[10]。TNF-α能杀伤和消灭肿瘤细胞，限制肿瘤生长，最终导致肿瘤缩小、坏死而消失，对正常的机体和组织无毒性[11]，同时还能诱导和激活T、B淋巴细胞、增强NK细胞杀伤靶细胞促进吞噬功能等作用，因此，TNF-α的含量可直接反映机体的免疫功能。IFN-γ是活化的T细胞产生的细胞因子，具有多种潜能，在机体肿瘤发生、发展、移植排斥和肿瘤免疫逃逸中均有着重要作用[12-13]。IFN-γ对癌基因的表达具有抑制作用，能阻止或减慢肿瘤细胞的转化过程；还可激活各种免疫细胞如巨噬细胞、NK细胞等，发挥直接杀伤癌细胞或间接抑制癌基因的作用；诱导肿瘤坏死因子，促进癌细胞对TNF受体、MHC I1类抗原的表达，故IFN-γ在临床上用于抗肿瘤治疗已非常广泛[14]。本实验结果显示，小鼠患上肿瘤后TNF-α和IFN-γ含量明显下降，而经NCTD处理后，荷瘤小鼠TNF-α和IFN-γ含量明显提高，提示其可提高机体的免疫功能。

综上所述，去甲斑蝥素小鼠体内能抑制非小细胞肺癌的生长，其抗肿瘤作用与提高机体的免疫功能有关[15]，包括增加白细胞总数，促进T、B淋巴细胞增殖、上调TNF-α和IFN-γ水平以及调节免疫器官的生长，该效应在一定范围内呈现出剂量依赖性，随着给药剂量的增加而增强，其产生的抗肿瘤作用可能还有其他作用机制，尚需进一步研究。

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Effect of NCTD on immune function of mice with non-small cell lung cancer

FU Ying-ying1,LI Lin1,ZHANG Ji2,ZHANG Wen-jing2,SI Ying-ming1*

(1.Xiangyang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xiangyang 441000,China;2.Xiangyang Central Hospital,Xiangyang 441021,China)

Objective To study the immunomodulatory effect of NCTD on mice with 3LL.Methods Cells were cultivatedinvitro,ICR mice were inoculated the cells,then divided into 5 groups:negative control group,positive control group,NCTD three doses of groups,and control group was set in addition.After 2-weeks treatment,venous blood of all mice were collected for immune cell level detection,and the tumors,spleen,as well as thymus were dissected to weight viscera index,and lymphocyte proliferation was tested.Results NCTD inhibited cell growthinvivo,increased WBC in tumor-bearing mice and increased TNF-α and IFN-γ levels.It reduced spleen index and thymus index,promoted T/B lymphocyte proliferation.Conclusion NCTD can regulate immune function in mice with non-small cell lung carcinoma 3LL.

NCTD;3LL;Mice;TNF-α;IFN-γ

2014-09-23

1.襄阳市中医医院，襄阳 441000；2.襄阳市中心医院，襄阳 441021

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201506009