甘肃金银花(盘叶忍冬)抗菌作用实验研究

高晓东，李雪萍，李永辉，张永东，杨 凯，李海宁

1甘肃省疾病预防控制中心，甘肃 兰州 730000；

2甘肃省医学科学研究院转化医学研究中心

甘肃金银花(盘叶忍冬)抗菌作用实验研究

高晓东1，李雪萍2△，李永辉2，张永东2，杨 凯2，李海宁2

1甘肃省疾病预防控制中心，甘肃 兰州 730000；

2甘肃省医学科学研究院转化医学研究中心

目的：观察甘肃金银花（盘叶忍冬）对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的体内、外抗菌作用。方法：体内抗菌用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌感染小鼠，观测给药小鼠在染菌后7天内的死亡率；体外抗菌用琼脂扩散实验和菌落计数法测定最小抑菌浓度（M IC）和抑菌圈大小。结果：对感染金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌小鼠灌胃甘肃金银花（盘叶忍冬）后小鼠的死亡率分别为45%和40%；正品金银花为40%；两者与模型对照组小鼠死亡率的95%相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。体外抗菌实验测得甘肃金银花（盘叶忍冬）和正品金银花对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的最小抑菌浓度为6.25 m g/m L和12.5 m g/m L。结论：甘肃金银花（盘叶忍冬）对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌具有一定的体、内外抗菌作用。

甘肃金银花（盘叶忍冬）；体内外抗菌；金黄色葡萄球菌；大肠埃希菌

盘叶忍冬(Lonicera tragophylla Hemsl.)属忍冬科忍冬属落叶藤本,具有清热解毒、凉风散热之功效。临床上广泛用于急性热病及外科感染性疾病,如上呼吸道感染、急性扁桃体炎等［1-4］。本研究对甘肃金银花（盘叶忍冬）在抗炎、解热镇痛方面进行研究，取得了一定成果，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 药物 甘肃金银花（盘叶忍冬）水提浓缩物由甘肃省医学科学研究院药理毒理实验中心制备，药液浓度按生药量计算为2.63 g/mL，实验前用灭菌蒸馏水稀释成所需浓度。正品金银花购自甘肃省黄河药市，产地：山东，浓缩液制备同甘肃金银花。双黄连口服液(哈药集团三精制药股份有限公司生产，批号：13051324)。

1.2 动物 昆明种小鼠，SPF级，体质量18～22g，雌雄兼有，由甘肃省医学科学研究院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(甘)2006-0010。

1.3 菌株来源 金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠埃希菌（CCTCCAB200068）均由甘肃省医学科学研究院医学生物中心提供。

1.4 试剂与仪器 BUCHI461旋转蒸发仪(瑞士)；JA-2003电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；ClassⅡ，TypeA2型生物安全柜(力康集团全资附属公司新仪器上海有限公司)；立式压力蒸气灭菌器(LS-B50)；PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱(上海精密仪器厂)。

1.5 方法与步骤

1.5.1 体内抗菌实验 甘肃金银花(盘叶忍冬)对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌感染小鼠的保护作用。选取健康小鼠140只，体质量为18～22 g，雌雄各半，随机分为7组，即空白对照组、模型对照组、双黄连组、正品金银花组，甘肃金银花(盘叶忍冬)高剂量组(28.8g/kg)、中剂量组(14.4g/kg)、低剂量组(7.2 g/kg)。各组动物按剂量连续灌胃给药3天(空白对照组和模型对照组给予等容量蒸馏水，金银花对照组在感染菌前1天开始给药)，1次/d。感染前小鼠禁食过夜，第3天给药后30分钟，根据菌株毒力的预实验情况选用使80%～100%小鼠死亡的金黄色葡萄球菌的干酵母悬液8.6×105cfu/mL (或大肠埃希菌6.1×106cfu/mL)，0.5 mL/只，给小鼠腹腔注射造成感染(空白对照组注射等容量干酵母生理盐水溶液)。感染后6小时再给药1次，继续给药1天，观察和记录各组动物感染后7天内的反应情况以及死亡数［5-6］。

1.5.2 体外抑菌实验 将上述中药各称取20 g，加入约5倍量水，浸泡过夜后，文火煮沸30分钟，过滤后，再加5倍量水，文火煮沸30分钟，过滤。将2次滤液合并后在文火上浓缩至20 mL，即为100%中药原液。调pH值为7.6。

1.5.3 菌落计数法［7-8］将中药原液105℃，20分钟灭菌后即为实验药液。用接种环将金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌分别接种于琼脂斜面培养基，37℃培养24小时，传种于无菌肉汤培养基中经18小时，再传种于无菌肉汤培养基中培养6小时，用前将菌液浓度1∶1000稀释。取无菌试管270支，分3组，每管加肉汤培养基1 mL，第1管加所试药液混匀后，使1～9管均含有倍比稀释的药液(即1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024)。第1、2、3、4、5、6、7、8、9管每管加菌液0.05 mL，充分混匀后，37℃培养24小时，观察结果。药液对照管以第9管无细菌生长，菌液对照管第10管有细菌生长，实验方为有效。以能抑制试验菌生长的最高稀释度为最低抑菌浓度MIC。

1.5.4 琼脂扩散法［9］每平皿加0.1mL菌液(菌液浓度为1.0×105cfu/mL)，涂布整个培养基表面，37℃吸附30分钟，然后上面均匀放置4个直径约为6 mm的无菌不锈钢牛津杯。然后用移液器在孔中加药液200 μL；37℃恒温培养箱内培养24小时后观察并记录抑菌圈的有无及其直径大小(重复2次，每次做4孔，求直径的平均值)。

1.6 统计学方法 数据采用SPSS 10.0统计软件进行fisher确切概率法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体内抗菌实验 对感染金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌小鼠灌胃甘肃金银花(盘叶忍冬)后小鼠的死亡率分别为45%和40%；正品金银花为40%；两者与模型对照组小鼠死亡率的95%相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 甘肃金银花(盘也忍冬)对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌感染小鼠的保护作用(n=20)

2.2 体外抑菌实验 甘肃金银花(盘叶忍冬)和正品金银花对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的最小抑菌浓度为6.25 mg/mL和12.5 mg/mL。对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小分别为15 mm和19 mm；对大肠埃希菌的抑菌圈大小为16 mm和19 mm，见表2—3。

表2 最小抑菌浓度测定结果 m g/m L

表3 甘肃金银花(盘叶忍冬)琼脂扩散法抑菌实验结果(n=8)

3 讨论

3.1 体内抗菌实验 与空白对照组比较，模型对照组的小鼠死亡率为95.0%(P＜0.01)，表明浓度为8.6×105cfu/mL的金黄色葡萄球菌(或浓度为6.1×106cfu/mL大肠埃希菌)的干酵母悬液能引起小鼠死亡，造模成功。与模型对照组比较，双黄连口服液组与正品金银花组死亡率明显降低(P＜0.05)；甘肃金银花(盘叶忍冬)高、中、低各剂量组死亡率明显降低(P＜0.05)。提示甘肃金银花(盘叶忍冬)具有对金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌致小鼠感染死亡的保护作用，显示了一定的体内抗菌作用。体内抗菌实验主要研究药物对感染动物的预防和保护作用，因此体内抗菌实验是最重要的抗菌作用的研究方法，对于研究中药的抗微生物作用有重要意义。

本研究发现小鼠体内感染金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的急性死亡期主要集中在48小时之内，之后存活小鼠可逐渐恢复健康。此外，通过死亡小鼠尸体解剖发现，金黄色葡萄球菌能明显引起小鼠小肠炎性坏死，大肠埃希菌可致小鼠肺部感染坏死。

3.2 体外抑菌实验 甘肃金银花(盘叶忍冬)对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均具有抑制作用，对两种菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为6.25mg/mL和12.5 mg/mL，与正品金银花基本一致。较双黄连口服液对两种菌的抗菌作用弱，但差异无统计学意义(P＞0.05)，与空白对照(蒸馏水)比较，其抗菌作用差异有统计学意义(P＜0.05)。

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Experimental Study on Antibacterial Effects of Gansu Honeysuckle

GAO Xiaodong1,LI Xueping2△,LI Yonghui2,ZHANG Yongdong2,YANG Kai2,LI Haining2
1 TCM Department of Gansu Provincial Center for Disease Control and Prevention，
Lanzhou 730000,China；
2 Medical Transformation Research Center of Gansu Provincial Medical and Scientific Academy

Objective:To observe antibacterial effects of Gansu honeysuckle(Lonicera tragophylla Hemsl.)on Staphylococcus aureus(SA)and E.coli in vivo and vitro.Methods:Mortality rate of the medicated mice were detected in seven days after the mice were infected by SA and E.coli;minimal inhibitory concentration(MIC)and the size of inhibition zone were measured through agar diffusion experiments and bacterial colony counting method.Results: SA-infected and E.coli-infected mice were treated by Gansu honeysuckle and genuine honeysuckle,mortality rates of SA-infected and E.coli-infected mice treated by Gansu honeysuckle were 45%and 40%respectively;mortality rate of genuine honeysuckle was 40%;the difference was significant when both were compared with model control group with the mortality rate 95%(P＜0.05).The results of antibacterial test showed that MIC of Gansu honeysuckle and genuine honeysuckle against SA and E.coli were 6.25 and 12.5 mg/mL.Conclusion:Gansu honeysuckle shows antibacterial effects to SA and E.coli in vivo and vitro to a certain degree.

Gansu honeysuckle(Lonicera tragophylla Hemsl.);antibacterial effects in vivo and vitro;SA;E.coli

R284.1

A

1004-6852(2015)11-0017-03

2014-12-15

高晓东(1964—)，男，副主任医师。研究方向：中药药理。

△通讯作者：李雪萍(1964—)，女，副主任检验师。研究方向：中药药理。