苦豆子籽总生物碱分离纯化工艺研究

郭鸿雁，冷晓红，陈海燕，郝彩琴

1宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021；2宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心

苦豆子籽总生物碱分离纯化工艺研究

郭鸿雁1，2，冷晓红1，2，陈海燕1，2，郝彩琴1，2

1宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021；2宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心

目的：选用大孔树脂纯化苦豆子籽提取液的生物碱的纯度，提高生物碱的纯度。方法：pH=9，浓度为2.0～2.5 m g/m L的料液，抽滤加氯化钠(1.0 m ol/L)，以树脂重量与样品的体积比为1∶3上柱，用3倍样品体积pH=9的30%乙醇先洗脱，再用3倍样品体积pH=9为70%乙醇洗脱。结论：选用非极性D 101大孔树脂直接从苦豆子籽提取液中分离纯化生物终产品总碱纯度可达60%以上，洗脱率为97%以上，分离效果好。

苦豆子籽；大孔树脂；分离纯化

苦豆子(Sophora alopecuroides L.)为豆科植物的干燥全草及种子。产于宁夏、内蒙古、新疆等地。由于其较高的药用价值和生态功能，苦豆子资源的合理保护与开发利用越来越引起人们的重视，宁夏回族自治区已将苦豆子列入重点保护的六大道地药材之一，纳入国家中药现代化科技产业行动计划中，生产基地建设和深层次开发都有长足的发展。苦豆子味极苦、性寒有毒，具有清热解毒，抗菌消炎、止痛杀虫等作用。目前苦豆子籽的分离纯化方法常采用溶剂提取、离子树脂交换法。溶剂提取不利点是因使用有机溶剂多为甲苯、氯仿、甲醇，对环境、人体存在一定危害并残存于提取物中；离子树脂交换法一般是利用阳离子树脂的酸根与生物碱的胺基基团作用，将生物碱富集在树脂上，再用碱液将生物碱解离，得到游离的生物碱，缺点是生物碱与树脂的结合力强，不能将生物碱完全洗出，所以主要生物碱的损失较大，本实验选用大孔树脂与离子树脂不同的是不交换基团，它主要是依靠物质间范德华力、偶极力和氢键力来进行物质间的分离。本实验大孔吸附树脂对苦豆子籽中的生物碱进行分离，先通过静态吸附与解吸实验选出最佳树脂；然后通过动态吸附实验考察上柱量、上柱液pH等因素对吸附率的影响，确定最佳上柱条件；找出最佳的洗脱条件。常用的洗脱剂有：甲醇、乙醇、四氯化碳、丙酮、水等，为减少产品的有害溶剂残留及降低环境污染，本实验选用乙醇与水。

本实验选用非极性D101大孔树脂直接从苦豆子籽提取液中分离纯化生物终产品总碱纯度可达60%以上，洗脱率在97%以上，分离效果好，该法的优点是生物碱吸附速度快，洗脱容易，树脂的寿命长，为其产业化提供技术保障，使其易于生产，创造更大的社会效益和经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 苦豆子提取液，实验室制备；溴麝香草酚蓝，分析纯，上海恒远生物科技有限公司提供；乙醇，分析纯，天津试剂有限公司一分厂生产；盐酸，分析纯，天津试剂有限公司一分厂生产；氢氧化钠分析纯，天津试剂有限公司一分厂生产；pH试纸，上海黄海试剂厂生产；D101树脂(实验级)、AB-8树脂(实验级)，上海天莲树脂有限公司生产；中极性树脂BS-30(实验级)、弱极性树脂BS-67-2(实验级)、非极性树脂BS-67-3(实验级)，蚌埠市辽源生物科技有限公司生产；槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱，由中国食品药品生物鉴定所提供；碘化铋钾，分析纯，天津双双试剂有限公司提供。

1.2 仪器 BT-101电子蠕动泵(上海信宜仪器有限公司生产)，RE-6000A旋转蒸发仪(上海亚荣实验仪器有限公司生产)，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城仪器有限公司生产)，XS105DU电子天平(梅特勒生产)，TU-1810紫外可见分光计(北京普析色谱仪器有限公司生产)，1220高效液相色谱仪(美国安捷伦公司生产)，Φ2 cm×50 cm、 Φ150cm×1 000 cm层析柱(定制)，HG90708恒温鼓风干燥箱(上海琅玕实验仪器有限公司生产)，LD-S-10［1］低速离心机(北京时代北利离心机有限公司生产)。

1.3 实验方法

1.3.1 大孔树脂预处理 将20 g树脂使用95%的乙醇溶液浸泡24小时，保证树脂充分溶胀，湿法装柱，柱高60 cm，直径15 cm，用乙醇95%溶液淋洗至洗脱液与水混合(1∶2)不成白色混浊为止，再用纯化水洗至无醇味，2%的盐酸溶液浸泡3小时，水洗至中性流数为4～6 BV/h，5%氢氧化钠溶液浸泡3小时，水洗至中性流数为4～6 BV/h，备用。

1.3.2 大孔树脂筛选 对弱极性、非极性、中极性树脂进行比较筛选。取苦豆子籽浓缩提取液适量2%NaOH调pH至9，离心、过滤备用。将经过预处理过的树脂，加入浓缩样波美度5(下总碱都是以五总碱计，5种碱为氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、苦参碱、槐果碱)供试液70mL，浓度2.20mg/mL，上样总碱量154 mg，静止24小时，使之充分吸附，取流出液用液相测定总碱，6倍上样体积70%乙醇洗脱柱6次，使用洗脱剂共计300 mL，收集洗脱液测总碱。见表1。

表1 大孔树脂筛选

吸附率=(吸附前上样总碱量-吸附后续滤液总碱量)/吸附前上样总碱量×100%

洗脱率=洗脱出总碱量/吸附总碱量×100%得出非极性树脂吸附与洗脱性能良好。

1.3.3 非极性树脂筛选 经过预处理过非极性树脂D101、AB-8、BS-67-3加入供试液上样供试液70 mL，浓度2.20 mg/mL，上样总碱量154 mg使之充分吸附，取续滤液用液相测定总生物碱，6倍上样体积70%乙醇洗脱柱6次，使用洗脱剂共计300mL，收集洗脱液测总碱。得出D101树脂吸附与洗脱性能良好。见表2。

表2 非极性树脂筛选

1.4 吸附液pH考察 处理D101树脂柱10根(2cm×50cm)，树脂量为20g，样品浓度为2.29mg/mL (液相测得)，分别用2%盐酸与5%氢氧化钠调节不同数值pH上样，用改良碘化铋钾试液喷在滤纸上，检测流出液中是否有生物碱，如果滤纸试纸变色，则有生物碱流出，无变色继续上样，直至变色为止。得出pH4、pH9、pH10吸附总碱量高，树脂的耐受范围pH4～10，取pH9上样。见表3。

表3 吸附液pH考察

1.5 不同乙醇洗脱液浓度的考察 配制不同浓度的乙醇作为洗脱液，洗脱以上3.4吸附柱，6倍上样体积不同浓度乙醇洗脱柱6次，收集洗脱液，用液相测总碱。得出洗脱乙醇浓度在30%～70%之间洗脱生物碱量高，极性强的生物碱在低浓度洗脱量高，非极性生物碱在高浓度洗脱量高。见表4。

表4 不同乙醇洗脱液浓度的考察

1.6 样品中加氯化钠对吸附量的考察 生物碱在吸附过程中加入氯化钠，因盐析的作用降低生物碱的溶解趋势，显著增加吸附速度及吸附容量，从而与其他成分分离，提高树脂的分离纯化提取率，但氯化钠的量的加入有一定的范围，通过上样样品中(浓度2.20 mg/mL液相测得)加入不同浓度的氯化钠，再加入树脂柱中，用改良碘化铋钾试液喷在滤纸上，检测流出液中是否有生物碱，如果滤纸试纸变色，则有生物碱流出，无变色继续上样，直至变色为止。见表5。

表5 样品中加氯化钠对吸附量的考察

显然，随着NaCl浓度的增大吸附量也随着增大，然而NaCl浓度大于1 mol/L以后，增加NaCl浓度，树脂对生物碱吸附的量无增加，并且浓度越大将来对生产设备的腐蚀越强，因此上柱液的盐离子浓度定为1 mol/L。因该大孔树脂对Na+，Cl-均不吸附，故添加NaCl对于生物碱纯度及活性并无影响。

1.7 不同PH 70%乙醇洗脱剂洗脱率考察 使用3.6吸附样品的树脂柱进行不同pH70%乙醇洗脱剂实验，6倍上样体积不同pH70%乙醇洗脱柱6次，收集洗脱液，液相测总碱。见表6。

表6 不同pH 70%乙醇洗脱剂洗脱率考察

pH是9，70%的洗脱率最高。

1.8 不同梯度浓度洗脱液的考察 样品加浓度为1.0 mol/L的氯化钠，浓度为2.20mg/mL(液相测得)上柱，pH为9，每个柱子上样70mL，总碱154mg，进行不同梯度pH9乙醇的洗脱剂洗脱，收集不浓度的洗脱液用液相测总碱，再计算不同梯度组总碱量。数据观察得出第一组的洗脱总碱量高，但从生产工艺简单角度考虑，工业蒸发回收的乙醇-水即可达到70%～30%的浓度，使之可以循环利用，既节约资源又提高效益，故以30%～70%洗脱梯度为最佳。见表7。

表7 不同梯度浓度洗脱液的考察

1.9 树脂连续上样次数的考察 样品加氯化钠1.0 mol/L，浓度为2.20 mg/mL(液相测得)上柱，pH为9，每次柱子上样70 mL，154 mg，连续上10次样，洗脱液pH值为9，用30%～70%乙醇分别用(3倍上样量)210 mL洗脱液洗脱，收集洗脱液用液相测总碱量。从树脂上样次数分析，树脂可以连续上样，最少可以连续10次，直至吸附量降到90%，进行树脂再生。见表8。

表8 树脂连续上样次数的考察

1.10 中试放大200倍 分别处理树脂3 kg，装入150 cm×1 000 cm层析柱中，分别上超声乙醇提取浓缩液，经过加5%氢氧化钠pH至9，离心过滤料液10 L，液相测总碱浓度为2.47 mg/mL，用pH9，30%～70%乙醇洗脱剂，梯度洗脱，蠕动泵收集洗脱液，洗脱液收集后用液相测总碱，再将洗脱液减压旋转蒸发，得膏状产品。膏状产品，分别用液相(溴麝香草酚蓝比色法)测总碱，减重法测水分。见表9。

表9 中试放大200倍

1.11 树脂再生的考察 95%乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡3小时，用水洗至中性，再用2%氢氧化钠浸泡3小时，用水洗至中性，吸附效果同新处理树脂。

2 结果

pH值为9，且浓度为2.0～2.5 mg/mL(5种碱计)的料液，抽滤加氯化钠(1.0 mol/L)，以树脂重量与样品的体积比为1∶3上柱，用3倍样品体积30%乙醇(pH=9)先洗脱，再用3倍样品体积70%乙醇(pH=9)洗脱。按此条件纯化，苦豆碱提取率在97%以上，终产品总生物碱纯度可达60%以上。

3 讨论

有机溶剂提取分离技术是天然产物分离的经典技术，由于苦豆子生物碱特别是生物碱的氮氧化物水溶性较大，很难萃取完全，加上界面时有乳化等因素导致萃取效率较低，生物碱的得率低，尤其是常使用有机溶媒为氯仿、甲醇、甲苯对设备要求高，而且对操作者、环境有一定危害，产品残存有剂溶媒，一般仅适用于实验室小量样品的制备，而不宜用于工业生产［1-3］。

离子交换法用离子交换树脂提取恰好可解决萃取的这些问题，有机溶媒用量少，但本实验中的苦参类生物碱与离子交换树脂键合力太强［4-8］，用大量的碱性(pH9)乙醇-(70B30)长时间洗脱，生物碱也不能完全洗出，树脂的再生利用也困难，主要生物碱的损失较大，生物碱的得率也低。

大孔树脂具有的吸附能力强，预处理简单，容易洗脱，机械强度大，容易再生，使用寿命长，液体流动阻力低，抗有机污染能力强，规模放大效应好等优点。使用的NaOH、HCl和NaCl价廉易得，所产生的废水既易于中和排放，其中使用的乙醇可收循环利用，尤其选用的D101大孔树脂对生物碱吸附速度快、吸附量大，且洗脱既快又彻底，生产周期短，符合当前的清洁生产，绿色环保生产，是一种经济有效的生产方式，是当前工业生产趋势。

［1］ 崔九成，佟姝丽.氧化苦参碱的提取分离工艺研究［J］.陕西中医学院学报，2000，23(5):51-52.

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［8］ 秦学功.苦豆子生物碱分离纯化与生物活性研究［D］.天津:天津大学，2002.

Study on the Separation and Purification of Total Alkaloids from the Seeds of KuDouZi

GUO Hongyan1,2,LENG Xiaohong1,2,CHEN Haiyan1,2,HAO Caiqin1,2
1 Ningxia Polytechnic,Yinchuan 750021,China;
2 Ningxia Engineering Research Center of Chinese Medicine Development and Utilization

Objective:To increase the purity of alkaloids by applying macroporous resin to total alkaloids from the extract of KuDouZi(Sophora alopecuroides L)seeds.Methods:Feed liquid,scaling pH=9,in the concentrations of 2.0 and 2.5 mg/mL,leaching and adding sodium chloride (1.0 mol/L),the weight of macroporous resin and the volume of the samples were in the ratio of 1:3 on the column,three times of the volume of the samples,pH=9,were used to elute firstly,and then three times volume of 70%ethanol with pH=9 were used.Conclusion:Non-polar D101 macroporous resin is chosen to separate and purify total alkaloids of the extract of KuDouZi seeds directly,which could make the purity of total alkaloids more than 60%,elution rate higher than 97%and obtaining good separation effects.

the seeds of KuDouZi;macroporous resin;separation and purification

R284.2

A

1004-6852(2015)10-0049-04

2014-12-08

郭鸿雁(1967—)，女，高级工程师。研究方向：生物制药。