慢病毒介导GFP转染小鼠ESC及其对干细胞特性的影响

张爱霞

慢病毒介导GFP转染小鼠ESC及其对干细胞特性的影响

张爱霞

目的 研究用慢病毒载体进行基因转染对小鼠胚胎干细胞(ESC)特性的影响。方法 慢病毒载体经293FT细胞包装后转染小鼠ESC, 荧光显微镜下挑选和观察所得阳性克隆, 检测ESC特异性标志物Oct-4、SSEA-1的表达, 通过拟胚体(EB)诱导体外分化, RT-PCR检测三胚层的分化。结果 形态学观察可见所得绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞呈克隆样鸟巢状生长, 免疫组化可见GFPESC表达ESC特异性标志Oct-4、SSEA-1, 能形成EB, RT-PCR检测到甲胎蛋白(AFP)、巢蛋白(Nestin)和血管内皮生长因子受体(Flk-1)的表达。结论 慢病毒载体介导的基因转染不影响小鼠ESC的自我更新特性及多向分化潜能。

胚胎干细胞；慢病毒载体；基因转染；绿色荧光蛋白

胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)是从附植前早期胚胎内细胞团或早期胎儿原始生殖细胞经体外分离培养而来的多能性细胞系。ESC因能够无限增殖并保持未分化状态和具有向3个胚层细胞分化的潜力, 在研究胚胎发育关键基因功能、建立疾病模型等方面有着其他细胞无法比拟的优势。转基因研究是更有效利用ESC进行各种基因功能研究以及基因治疗等的重要手段。研究表明, 自身失活的慢病毒载体(lentivirus vectors, LV)是安全而且有效的转基因载体［1,2］。本文利用慢病毒载体对小鼠的ESC进行转染, 研究慢病毒转染对ESC的干细胞特征的影响, 为以后的ESC转基因研究提供借鉴。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 小鼠ESC细胞系E14.1、293FT细胞、含ubiquitin C promoter-GFP的慢病毒载体由中山大学中山医学院干细胞与组织工程中心提供。高糖DMEM 培养基、ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix、Lipofectamine 2000和Opti-MEM培养基均购于美国Invitrogen公司； 胎牛血清购于美国Hyclone公司；白血病抑制因子(LIF)购于Chemicon 公司；免疫组化用一抗Oct-4、SSEA-1 抗体均购于美国Millipore公司；二抗购于美国R＆D 公司；明胶购于美国Sigma公司。

1.2 ESC与293FT细胞的体外培养 ESC的培养用含10%胎牛血清、1 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、1000 U/ml LIF的高糖DMEM完全培养液, 接种到2%明胶包被的培养皿中, 37℃、5% CO2的培养箱中培养。293FT细胞用含10%胎牛血清、0.1 mmol/L非必需氨基酸、500 μg/ml G418的高糖DMEM完全培养液培养, 细胞融合达80%～90%进行传代培养。

1.3 慢病毒的包装 取9 μg的ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix和3 μg的ubiquitin C promoter-GFP载体加入到1 ml的Opti-MEM培养液中混匀。另取36 μl的Lipofectamine 2000加入到1 ml的Opti-MEM培养液中混匀, 室温放置5 min。混和DNA和Lipofectamine 2000的Opti-MEM培养液, 室温放置20 min后加入含5×106个293FT细胞的无G418的培养液中, 培养24 h后换液。转染72 h后收集含有病毒的培养液, 3000 rpm离心30 min, 0.45 μm滤膜过滤。

1.4 慢病毒转染ESC及阳性细胞克隆的筛选 将培养于6孔板2 d的ESC每孔加入病毒悬液0.5 ml, 培养12 h后换液。72 h后荧光显微镜下观察发光情况, 选择阳性克隆, 胰酶消化离心后以10个/cm2接种密度再次接种到明胶覆盖的培养皿中, 培养72 h后荧光显微镜下选择阳性克隆, 再次消化传代。连续选择2～3次, 便可得到纯的表达绿色荧光蛋白的胚胎干细胞克隆, 称为GFP-ESC。

1.5 GFP-ESC的形态学观察 GFP-ESC接种在2%明胶包被的培养皿中, 荧光显微镜下观察细胞集落的形态特征及生长状态。

1.6 免疫组化检测表面分子标志物 将种植于6孔板上的GFP-ESC用PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定20 min, 用二抗宿主血清封闭30 min。加入一抗抗体Oct-4(1：200 稀释)、SSEA-1(1：100稀释)并于4℃孵育过夜。PBS 洗涤, 以Cy3标记的相应二抗室温孵育1 h, PBS洗涤, 荧光显微镜下观察。

1.7 GFP-ESC体外分化检测 将GFP-ESC接种在低粘附性的培养皿中, 以不含LIF的ESC培养液悬浮培养, 将形成的拟胚体(embryoid body, EB)在荧光显微镜下观察, 悬浮培养10 d后, 提取总RNA作RT-PCR检测以鉴定胚体中三个胚层来源细胞的存在。

1.8 RT-PCR检测 按照试剂盒要求从EB中抽提RNA, 检测Nestin、Flk-1和AFP。PCR 条件：94℃ 4 min, 30个周期(94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 68℃ 1 min), 72℃ 10 min。引物序列(5′-3′)：巢蛋白：正向 CTCTCCCTGACTCTACTCCCT, 反向CATCTTCTTCC TCTCCCTCTT；Flk-1：正向TAGGTGCCTCCCCATACCCTGG,反向TGGCCGGCTCTTTCGCTTACTG；甲胎蛋白：正向 GCT CACACCAAAGCGTCAAC, 反向CCTGTGAACTCTGGTATCAG。

2 结果

2.1 GFP-ESC的生长状态 GFP-ESC具有典型的克隆形态,呈鸟巢状, 边缘清楚, 表面平滑,结构致密, 细胞小而圆, 细胞之间界线不清楚。见图1。

图1 GFP-ESC细胞克隆(×100)

2.2 胚胎干细胞特异性标志免疫组化检测 荧光显微镜下观察GFP-ESC免疫荧光染色结果, 可见呈红色荧光的Oct-4、SSEA-1 的表达。见图2。

图2 小鼠GFP-ESC的特异性标志物的免疫荧光分析(×400)

2.3 GFP-ESC的体外分化能力 用不含LIF 的ESC培养液体外悬浮培养后, GFP-ESC能形成简单拟胚体或是囊状拟胚体, 荧光显微镜下观察可见GFP的表达。将拟胚体抽提RNA, RT-PCR检测到AFP、Nestin和Flk-1的表达。见图3。

图3 小鼠GFP-ESC的体外分化(×100)

3 讨论

细胞转染的载体有病毒载体和非病毒载体两类。非病毒载体的转染中较多应用脂质体或电穿孔法, 但脂质体和电穿孔对细胞毒性较大, 特别是对干细胞转染效率较低［3,4］。病毒载体目前有腺病毒载体、慢病毒载体、反转录病毒载体。腺病毒属于双链DNA病毒, 其转染后病毒基因游离于宿主细胞基因组外, 瞬时表达外源基因。反转录病毒属于RNA病毒,其转染后病毒基因能够整合到宿主细胞基因组内, 能够稳定、长时间表达外源基因, 但是反转录病毒只转染分裂细胞, 不转染静止期细胞, 且对干细胞转染效率不高［5,6］。慢病毒属于逆转录病毒的一种, 为非致癌性病毒, 可以高效感染处于分裂期和非分裂期的细胞, 借助慢病毒可将其携带的外源基因高效整合进宿主细胞基因组中, 从而使基因稳定持久地表达, 成为当前转基因载体研究的热点［7,8］。

研究表明, 慢病毒与其他病毒载体相比较有着高效的转染率, 尤其对难转染细胞, 如原代细胞、干细胞, 其转染效率达75%以上［9,10］。在本研究中, 慢病毒转染后72 h进行荧光显微镜下观察, 也可见到明显的转染的阳性克隆, 说明慢病毒对于ESC是一种高效的转染载体。慢病毒转染后的GFP-ESC仍然维持其自我更新特性, 胚胎干细胞的标志分子表达阳性, 仍然具有向三胚层分化的潜能, 表明慢病毒载体是ESC转基因研究中的理想转染介质。

综上所述, 本实验证实携带GFP的慢病毒可高效感染小鼠ESC, 其对细胞的自我更新以及多向分化潜能均无影响,从而为后续进行携带外源基因的功能研究以及建立疾病模型等方面奠定了坚实的基础。

［1］ Joyeux L, Danzer E, Limberis MP, et al.In utero lung gene transfer using adeno-associated viral and lentiviral vectors in mice.Hum Gene Ther Methods, 2014, 25(3):197-205.

［2］ Lin L, Wei J, Chen Y, et al.Induction of antigen-specific immune responses by dendritic cells transduced with a recombinant lentiviral vector encoding MAGE-A3 gene.J Cancer Res Clin Oncol, 2014, 140(2):281-289.

［3］ Jo J, Tabata Y.Non-viral gene transfection technologies for genetic engineering of stem cells.Eur J Pharm Biopharm, 2008, 68(1):90-104.

［4］ Seo SJ, Kim TH, Choi SJ, et al.Gene delivery techniques for adult stem cell-based regenerative therapy.Nanomedicine (Lond), 2013, 8(11):1875-1891.

［5］ Nowakowski A, Andrzejewska A, Janowski M, et al.Genetic engineering of stem cells for enhanced therapy.Acta Neurobiol Exp(Wars), 2013, 73(1):1-18.

［6］ 何跃, 肖明朝, 聂永华.慢病毒介导KCNMA1体外转染大鼠间充质干细胞及功能测定.中国细胞生物学学报, 2012, 34(11): 1110-1116.

［7］ Jiang L, Wang F, Lin F, et al.Lentivirus-mediated overexpression of TGF-β inducible early gene 1 inhibits SW1990 pancreatic cancer cell growth.Cell Biol Int, 2011, 35(9):891-896.

［8］ Jidong W, Shuang L, Hongjuan P, et al.Lentivirus vectors mediated eGFP transfected into rat ovary in vivo.Clin Exp Obstet Gynecol, 2013, 40(1):101-105.

［9］ 唐莉, 常静.携带GFP 的慢病毒感染人脐带间充质干细胞及其对Oct4 表达的影响.细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29(3):292-296.

［10］ 马晓生, 姜建元, 吕飞舟, 等.腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质充质干细胞的比较.中华医学杂志, 2006, 86(47):1207-1210.

Lentiviral mediated GFP in transfection of mice ESC and its influence on stem cell features

ZHANG Ai-xia.
School of Bioscience, Jiaying College, Meizhou 514015, China

Objective To study the influence of gene transfection by lentiviral vector on mice embryonic stem cell (ESC) features.Methods Transfection of mice ESC was made by lentiviral vector after 293FT cell packing.Positive clone was chosen and observed under fluorescence microscope.Expressions of Oct-4 and SSEA-1 as ESC specific markers were detected.In vitro differentiation was induced by embryoid body (EB), and RT-PCR was applied to detect differentiation of triploblastica.Results Green fluorescent protein (GFP) positive cell showed colon bird-nest growth by morphological observation.Immunohistochemistry showed Oct-4 and SSEA-1 as ESC specific markers could form EB.Expressions of alpha fetoprotein (AFP), nestin and vascular endothelial growth factor receptor (Flk-1) could be detected by RT-PCR.Conclusion Gene transfection mediated by lentiviral vector has no influence on self-renewal feature and multi-directional differentiation potency of mice ESC.

Embryonic stem cell; Lentiviral vector; Gene transfection; Green fluorescent protein

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.11.002

2014-11-20］

514015 嘉应学院生命科学学院, 中山大学中山医学院干细胞与组织工程中心