再生障碍性贫血患者外周血CD55、CD59表达分析

张 丽 陈婷婷 刘永林 周郁鸿 李晓芳 陈益民

再生障碍性贫血患者外周血CD55、CD59表达分析

张 丽 陈婷婷 刘永林 周郁鸿 李晓芳 陈益民

再生障碍性贫血；CD55；CD59；C3；C4；免疫球蛋白再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是一种多原因引起的血液疾病，近年来T细胞免疫诱导的重要性在再障发病机制中逐渐被揭示[1-2]，本课题前期亦证实AA患者外周血存在T细胞的异常活化[3-4]和调节性T细胞的异常[5]，但体液免疫在AA发病机制的作用仍然存在争论，因此我们通过检测AA患者外周血粒、红细胞表面CD55和CD59的表达和补体的变化，探讨补体系统在AA发生过程中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2010年7月—2012年9月在浙江省中医院门诊或住院就诊AA患者81例，其中男40例，女41例，年龄5~77岁，中位年龄31岁，平均（33.7±20.6）岁；所有病例均为初次就诊，诊断均参照文献[6]。非AA组为浙江省中医院体检人群，共31名，其中男17名，女14名，年龄13~64岁，中位年龄33岁，平均（31.2±15.4）岁，外周血细胞计数排除AA和明显感染。

1.2 仪器与试剂 美国BD公司PE-anti-CD55鼠抗人单克隆抗体,PE-anti-CD59鼠抗人单克隆抗体单抗体、PC5-anti-CD19鼠抗人单克隆抗体、鼠抗人PE-anti-IgG1同型对照、鼠抗人PC5-anti-IgG1同型对照。美国Beckman公司IgG、IgA、IgM、C3、C4试剂。美国Beckman公司EPICS-XL流式细胞仪、Immage全自动特定蛋白仪。

表1 两组CD55、CD59表达与血清补体比较（±s）

表1 两组CD55、CD59表达与血清补体比较（±s）

注：与非AA组比较，t=3.715、2.777、3.732、3.711、4.935、6.809，△P<0.05；AA：再生障碍性贫血

组别非AA组AA组例数31 81红细胞（%） 粒细胞（%）CD55 97.92±1.40 94.54±7.88△CD59 97.85±1.67 93.06±15.28△CD55 99.28±0.69 91.92±17.72△CD59 97.88±2.20 93.83±9.17△C3（g/L）1.03±0.26 0.86±0.11△C4（g/L）0.30±0.10 0.20±0.05△

1.3 指标检测 两组均取外周血5mL，其中2mLEDTA-K2抗凝备用，3mL全血静置15min后，2000rpm离心5min，取血清，全自动特定蛋白仪检测IgG、IgA、IgM、C3、C4含量。取抗凝的外周血1μL，加入PBS缓冲液200μL稀释，然后取3根试管，分别加入稀释后红细胞20μL和PE-anti-CD55抗体20μL、稀释后红细胞20μL和PE-anti-CD59抗体20μL、稀释后红细胞20μL和PE-anti-IgG1抗体，室温孵育30min，加入PBS绶冲液1mL，上流式细胞仪分析。另取3根试管，分别加入全血100μL，再加入0.84%NH4Cl，室温放置30min，加入PBS 5mL，1500rpm离心5min，弃上清，分别加入PE-anti-CD55、PE-anti-CD59、PE-anti-IgG1抗体，室温孵育30min，加入PBS缓冲液1mL，上流式细胞仪分析。取2根试管，分别加入全血100μL，分别加入PC5-anti-CD19、PC5-anti-IgG1抗体，室温孵育30min，再加入0.84%NH4Cl，室温放置30min，加入PBS 5mL，1500rpm离心5min，弃上清，加入PBS缓冲液1mL，上流式细胞仪分析。

表2 两组外周血B细胞比例与免疫球蛋白IgG、IgA、IgM比较（±s）

表2 两组外周血B细胞比例与免疫球蛋白IgG、IgA、IgM比较（±s）

注：AA：再生障碍性贫血

非AA组AA组1.32±0.43 1.41±0.47 31 81 10.36±2.26 9.43±6.48 16.10±3.8 15.45±4.62 3.21±0.65 3.65±0.72

2 结果

2.1 两组CD55、CD59表达与血清补体比较 与非AA比较，81例AA患者外周血红、粒细胞CD55和CD59表达、血清补体含量显著降低（P<0.05），见表1。

2.2 两组外周血B细胞比例与免疫球蛋白IgG、I-gA、IgM比较 与非AA组比较，AA患者外周血B细胞比例与免疫球蛋白IgG、IgA、IgM差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

3 讨论

CD55又称促衰变因子，广泛分布在血细胞、黏膜上皮细胞和其他组织细胞表面，能与细胞表面瞬时形成的C3转化酶裂解失活；CD59又称膜反应性溶血抑制剂，广泛分布于各个血细胞和组织细胞的表面，主要组织膜攻击复合物的形成。CD55、CD59作为主要的膜结合调节蛋白，保护宿主正常细胞免遭补体活化介导的损伤[7]。造血干细胞存在PIG-A基因突变，可导致锚蛋白CD55、CD59表达缺失。文献报道AA造血干细胞存在PIG-A突变和体液免疫异常[8]。因此本课题组检测81例AA患者外周血红、粒细胞CD55、CD59的表达，发现AA患者外周血中粒、红细胞的CD55和CD59的表达较非AA组显著下降，血清C3、C4浓度较正常组降低，结果与李玉云等[8]结果一致。推测由于再障患者免疫功能紊乱、造血微环境异常等，部分干细胞可发生PIG-A基因突变，使CD55、CD59表达减少，降低对补体活化的抑制，从而使补体活化增强，水平降低。当CD55、CD59降低一定程度，血细胞则会出现获得性膜缺陷，发生溶血。AA患者CD55、CD59表达缺失和补体数量的异常提示补体系统在AA发生或病情进展过程中发挥重要的作用，检测外周血CD55、CD59及补体C3、C4等可能有助于AA的发现和疗效监测。

本研究发现，AA患者B细胞数量及免疫球蛋白IgG、IgA、IgM并无显著改变。提示抗体介导的体液免疫功能可能与再障发生、发展无关，抑或AA患者虽无数量的异常，但可能存在功能上的异常，这有待进一步研究证实。

［1］Kook H，Risitano AM，ZengW，etal.Changes in T-cell VB-repertoire in aplastic anemia：effects of different immunosuppressive regimens［J］.Blood，2002，99（10）：3668-3675.

［2］Maciejewski JP，Risitano A，Kook H，et al.Immune patho-physiology of aplastic anemia［J］.Int J Hematol，2002，76（suppl 1）：207-214.

［3］刘永林，周郁鸿，陈益民，等.流式荧光杂交技术检测再生障碍性贫血患者血清细胞因子［J］.临床检验杂志，2011，29（8）：572.

［4］朱琳超，刘永林，周郁鸿，等.流式细胞术检测慢性再生障碍性贫血患者T细胞活化的研究［J］.浙江中医药大学学报，2012，36（7）：767-769.

［5］刘永林，周郁鸿，陈益民，等.再生障碍性贫血患者外周血调节性T细胞γδT细胞表达分析［J］.浙江中医药大学学报，2012，36（10）：1077-1078.

［6］张之南.血液病诊断及疗效标准［M］.第3版.北京：科学技术出版社，2007：19-21.

［7］Ruiz-Argüelles A，Llorente L.The role of complement regu-Latory proteins（CD55 and CD59）in the pathogenesis of autoimmune hemocytopenias［J］.Autoimmun Rev，2007，6（3）：155-161.

［8］李玉云，昝丽娜，王卫国，等.再生障碍性贫血患者PIG-A基因外显子2、4、5突变及粒细胞CD55、CD59的表达［J］.癌变畸变突变，2009，21（4）：254-257.

（收稿：2015-03-05 修回：2015-04-20）

浙江省中医药科技计划项目（2013ZB045）

浙江中医药大学第一临床医学院（杭州 310006）

刘永林，13336165550