miR－514在肾癌中的异常表达及其临床意义

杨媛慧，路瑞静，杨会林，余振东

（1.北京大学深圳医院检验科，广东深圳518036；2.深圳市宝安区妇幼保健院检验科，广东深圳518133；3.北京大学深圳医院生物治疗室，广东深圳518036）

miR－514在肾癌中的异常表达及其临床意义

杨媛慧1，路瑞静2，杨会林1，余振东3＊

（1.北京大学深圳医院检验科，广东深圳518036；2.深圳市宝安区妇幼保健院检验科，广东深圳518133；3.北京大学深圳医院生物治疗室，广东深圳518036）

目的 探讨miR－514在肾细胞癌中的表达变化及其临床意义。方法 提取45例肾癌及其癌旁正常组织中的总RNA，逆转录后用实时荧光定量PCR的方法检测miR－514在肾癌组织和癌旁正常组织中的表达情况，并分析其与肾癌患者临床病理特征的关系。结果 与相应癌旁组织相比，miR－514在肾癌组织中表达量显著下调，下调率为86.67%。miR－514表达水平与患者年龄、性别、病理分型、TNM分期没有关系，但其表达水平与Fuhrman分级有关。结论 miR－514可能与肾癌的发生发展有密切关系，进行miR－514表达水平的研究可能对肾癌的早期诊断及治疗具有潜在的临床意义。

微小RNA；miR－514；肾细胞癌

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0933）

肾癌是临床常见的恶性肿瘤之一，但其发生发展的分子生物学机制尚未完全清楚，探索肾癌的致病因素对于了解肾癌的发病机制有着重要的意义。MicroRNA（miRNAs）是一类在多细胞生物中广泛分布的长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA［1，2］。突变或异常表达的miRNAs被认为发挥致癌或者抑癌作用，从而参与人类多种肿瘤的发生，包括肾癌、肺癌、宫颈癌、结肠癌等［3－6］。迄今为止，以早期诊断及治疗癌症为宗旨进行miRNAs的功能与癌症形成的相关性研究已成为国内外的热点课题之一。Zhou等通过第二代基因测序技术对10例肾细胞癌组织进行miRNAs的表达谱检测，发现miR－514在肾细胞癌组织中表达差异显著，癌组织较癌旁组织表达明显下调［7］。但目前为止，仍没有相关实验研究进一步证实这一检测结果。本实验主要采用实时荧光定量PCR技术检测肾细胞癌组织及其相应癌旁组织中miR－514的表达水平，从而对测序结果进行验证，并分析肾癌中miR－514的表达量与肾癌患者临床病理特征的关系，探讨miR－514在肾癌发展过程中的作用，可能为临床上肾癌的诊断及治疗提供新的生物学依据。

1 资料与方法

1.1 标本收集 45例肾细胞癌及其相应癌旁组织标本主要来自安徽医科大学附属医院及中山大学附属肿瘤医院行手术治疗的肾癌患者。患者术前均未作化疗、放射治疗或免疫治疗等抗肿瘤疗法。所有患者均签署知情同意书，并获得所在医院伦理委员会批准。应用国际抗癌组织（UTCC）／美国癌症联合会（AJCC）临床分期标准对肾癌患者进行临床病理分期。所得标本保存于RNAlater中并置于液氮或－80℃低温冰箱。45例肾癌患者的临床病理资料见表1。

表1 45例肾癌患者的临床病理资料

1.2 主要试剂及仪器 miRNAs逆转录试剂盒（miScript Reverse Transcription Kit）及荧光定量PCR试剂盒（miScript SYBR Green PCR Kit）均购自Qiagen公司（德国），特异性miR－514引物由Invitrogen公司（美国）合成，上游引物序列为：5’－ATTGACACTTCTGTGAGTAGA－3’。内参基因U6作为内参照进行归一化，其上游引物为5’－ACGCAAATTCGTGAAGCGTT－3’，下游引物均为miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒提供的通用引物。实验中用到的主要仪器：普通PCR仪（Bio－RAD）、荧光定量PCR仪（Lightcycler480II Roche）、电泳仪（Bio－RAD）、离心机（eppendor）、台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER）、普通冰箱及－80℃超低温冰箱。

1.3 总RNA提取及逆转录 用Trizol法分别提取45例肾癌组织及相应癌旁组织的总RNA。主要抽提步骤如下：①取－80℃冻存的肾癌及其相应的癌旁组织各50mg，在液氮中研磨；②加入1ml Trizol试剂（Invitrogen，美国），继续研磨成粉末状提取RNA；③用氯仿、100%异丙醇、75%乙醇分离并洗涤RNA沉淀；④用30μl无RNase Hσ2O溶解RNA。RNA提取完成后，用紫外光分光光度仪测定RNA的浓度及质量，并进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，－80℃保存备用。按照miScript Reverse Transcription Kit试剂盒说明书依次加入模板RNA和反应试剂，1μg RNA＋4μl Buffer RT＋2μl Nucleics Mix＋2μl Reverse Transcriptase Mix＋适量H2O，总反应体系为20μl。在普通PCR仪（Bio－RAD）上进行反应，条件为37℃、1h，95℃、5min。

1.4 实时荧光定量PCR检测 按照miScript SYBR Green PCR Kit说明书提供的方法，在Roche480定量PCR仪中进行实时荧光定量PCR反应，检测miR－514的相对表达量。反应条件为：第1步，95℃、15min；第2步，94℃、15S，55℃、30 S，70℃、30S，共45循环。每次反应均设置3个平行复孔。本实验设实验组和对照组两组。肾癌组织miRNAs表达量作为实验组（c）；相应癌旁组织miRNAs表达量为对照组（n）。miR－514作为两组的目的基因，U6作为内参进行标准化处理。CT值表示反映荧光强度到达阈值时所经过的扩增循环次数。△CTc＝CTc目－CTc内，△CTn＝CTn目－CTn内。目的基因的相对表达量（Re）采用△△CT的方法进行分析，△△CT＝△CTc－△CTn，Re＝ 2－△△CT［8］。

1.5 琼脂糖凝胶电泳 取1.4节中的扩增产物各5μl，与Loading Buffer均匀混合后加样至2%琼脂糖凝胶孔隙中。设电泳电压120V，时间30min。

1.6 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析。采用配对样本t检验分析肾癌及其相应癌旁组织的miR－514的表达差异；miR－514的表达量与肾癌患者临床病理特征的关系采用Mann－Whitney秩和检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA提取与质控 RNA提取完成后进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外照胶仪下显像示28S、18S两条清晰的主带，且28SrRNA在亮度上约为18SrRNA的2倍，两条带之间无弥散现象；紫外光分光光度仪检测RNA浓度均大于300ng／μl，260／280比值于1.8－2.0之间，表明提取的RNA浓度及质量良好。

2.2 实时荧光定量PCR扩增曲线及溶解曲线分析各样本经定量PCR扩增后，其扩增曲线均呈典型的“S”型，溶解曲线结果显示，miR－514及U6的基因产物均为单特异峰，峰值之前曲线平滑，没有明显的杂峰，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物，见图1。

图1 miR－514及U6实时荧光定量PCR扩增曲线及溶解曲线

2.3 miR－514在肾癌组织中低表达 miR－514的相对表达量（Re）经对数转换后得出－△△CT值，数据符合正态分布，表示癌组织与癌旁组织中miR－514的相对表达差异。运用SPSS17.0进行统计分析，如图2所示，miR－514在肾癌组织中呈显著低表达（t＝－7.01，P＜0.001）。45例配对标本中，miR－514下调表达的有39例，下调率为86.67%，见图2。

图2 miR－514在45例肾癌组织中的相对表达量

2.4 定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 电泳结果显示，癌组织标本的条带明显比癌旁组织标本暗，说明miR－514在肾癌组织中显著下调，电泳结果与实时荧光定量PCR检测结果一致（图3）。

2.5 miR－514表达量与肾癌患者临床病理特征之间的关系 采用Mann－Whitney秩和检验分析发现，miR－514的表达水平在高年龄组（＞53）及低年龄组（＜53）、性别、病理类型及TNM分期之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。而在Fuhrman分级中的G1－2和G3－4级之间的差异有统计学意义（T＝171，P＝0.031）。见表2。

图3 3例肾癌组织及其相应癌旁组织的定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

表2 miR－514表达量与肾癌患者临床病理特征之间的关系

3 讨论

泌尿系统中，肾癌是继前列腺癌和膀胱癌之后的第三大肿瘤［9］，约占成人恶性肿瘤的2%－3%［10］，但其致死率却高达40%［11］，目前全世界每年死于肾癌的患者有近10万例［12］，对人类的健康与生存构成了严重威胁。由于早期症状不明显，所以一直没有找到有效的方法来检测早期肾癌的发生。现有的放射性疗法、化学治疗及免疫治疗，都错过治疗的最佳时期，并且会产生严重的副作用。因此，寻找肾癌诊断与治疗的新靶点已成为临床上迫切需要解决的实际问题。

目前，肿瘤中miRNAs的表达和功能是研究的热点问题。越来越多的研究表明miRNAs在多种肿瘤的发生发展中起到了至关重要的作用［13］。如miR－10b抑制乳腺癌的转移［14］；miR－141和miR－200通过调控氧化应激反应作用于卵巢肿瘤发生［15］；miR－192调控靶基因rb1来抑制肺癌细胞的增殖并促进其凋亡［16］。这些研究证实了miRNAs在不同肿瘤的发生发展中扮演着抑癌或致癌的角色。

第二代基因测序的发展为肿瘤miRNAs表达谱的检测提供了比较成熟的技术平台，Zhou等应用第二代大规模平行测序技术检测肾癌组织miRNAs的表达谱，发现与相应的癌旁组织相比，miR－514在肾癌组织中表达明显下调［7］。本次研究中，我们主要应用实时荧光定量PCR技术着重对miR－514在45例肾癌及其相应癌旁组织中的表达进行验证。将得到的实验数据进行统计学处理后，发现在45例标本有39例肾癌标本中miR－514的表达明显低于其在癌旁正常组织中的表达，仅有6例肾癌标本中miR－514的表达高于其在癌旁组织中的表达，平均降低4.14倍，其结果具有统计学意义（t＝－7.01，P＜0.001）。除此之外，本研究还发现miR－514的表达在Fuhrman分级中的G1－2和G3－4级之间的差异有统计学意义（T＝171，P＝0.031）。这表明异常低表达的miR－514与肾癌细胞的分化程度密切相关，分化程度越低miR－514的表达量就越低，肾癌的恶性程度越高。因而，我们推测miR－514极有可能作为一种重要的抑癌基因，发挥抑癌基因的作用从而抑制肾癌的发生与发展，并且可能作为潜在的肾癌特异性标志物，提高肾癌的早期诊断率。

通过对45例临床肾癌标本及相应癌旁对照组进行初步实验研究，我们首次验证了在肾细胞癌及其相应癌旁组织中miR－514的表达量的差异，推测miR－514可能作为抑癌基因调控肾癌的发生和发展，实验设计简单、高度特异性、成本低廉及通用性好，可用于检测多种目的miRNAs。现阶段，关于miR－514的文献较少，其在肾癌发生发展过程中的功能及作用机制仍处于探索阶段尚未明确。但是随着对miRNAs研究的进一步深入，miR－514很可能在肾细胞癌的早期诊断、靶向治疗及预后判断等多个方面发挥重要的作用。

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The abnormal expression of miR－514 in human renal cell carcinoma and its clinical significance

YANG Yuan－hui1，LU Rui－jing2，YANG Hui－lin1，et al.（1.Department of Clinical Laboratory，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen518036，China；2.Bao′an District of Shenzhen Maternity and Child Health Hospital，Shenzhen 518133，China）

Objective To investigate the expression levels of miR－514in renal cell carcinoma and its clinical significance.Methods Total RNAs were isolated from 45pairs of human renal cell carcinoma and matched adjacent normal tissues.After reverse transcription，the expression of miR－514was analyzed by quantitative real－time PCR.Then the relationship between the expression level of miR－514and the clinicopathological characteristics was analyzed.Results Compared with the corresponding adjacent tissues，the expression of miR－514in renal cell carcinoma was significantly reduced，with an average of 4.14fold down－regulation.There’s no relation between the expression of miR－514and the age，gender，pathological classification and TNM stage of patients with renal cell carcinoma.However，the expression level of miR－514was related with the Fuhrman grade.Conclusion miR－514may be involved in the development and progression of renal cell carcinoma.This study of miR－514expression may present a potential significance in the early diagnosis and treatment of renal cell carcinoma.

microRNAs；miR－514；renal cell carcinoma

R737.11

A

2014－09－11）

1007－4287（2015）06－0933－04

2014年深圳市科技计划项目（JCYJ20140415162543037）；2014年深圳市卫生计生系统科研项目（201401049）

＊通讯作者