中药肠愈宁对溃疡性结肠炎癌变的干预作用

徐芳芳马伟明高志斌康年松

中药肠愈宁对溃疡性结肠炎癌变的干预作用

徐芳芳1马伟明1高志斌1康年松2

目的 观察自拟中药方肠愈宁预防、抑制溃疡性结肠炎癌变的作用。方法 健康SD大鼠60只，随机分为空白组、模型组、肠愈宁低、中、高剂量组和美沙拉嗪组，采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）化学诱导方法构建溃疡性结肠炎癌变大鼠模型。空白组不作任何处理。其余各组造模开始第1天开始给药，连续9周。观察大鼠一般情况、大便性状、体质量变化。实验结束，解剖观察大鼠结肠大体形态及结肠组织病理形态学变化。结果 ①模型组大体形态符合溃疡性结肠炎及癌变表现特点。②各组DAI评分比较：模型组（7.10±0.99）分、肠愈宁低剂量组（3.60±1.89）分、中剂量组（3.30±2.06）分、高剂量组（5.20±2.25）分、美沙拉嗪组（5.60±0.97）分，与空白组（0.50±0.53）分比较差异有统计学意义，P＜0.05；肠愈宁低、中、高剂量组、美沙拉嗪组与模型组比较，P＜0.05。③各组结肠大体形态评分比较：模型组（4.30±0.95）分、美沙拉嗪组（3.10±0.99）分、肠愈宁低剂量组（2.20±0.63）分、中剂量组（2.80±1.14）分、高剂量组（3.10±1.10）分，与空白组（0.10±0.32）分比较，P＜0.05。肠愈宁低、中、高剂量组、美沙拉嗪组与模型组比较，P＜0.05。④各组结肠组织学损伤评分比较：模型组（3.90±0.88）分、肠愈宁中剂量组（3.00±1.89）分、高剂量组（3.40±1.89）分、美沙拉嗪组（3.30±2.06）分，与空白组（0.10±0.32）分比较，P＜0.05。肠愈宁低剂量组（1.70±1.49）分与模型组比较，P＜0.05。结论 自拟中药方肠愈宁能明显减轻溃疡性结肠炎癌变大鼠模型的临床症状，改善组织病理类型，减少溃疡性结肠炎癌变。

大鼠；溃疡性结肠炎；癌变；中药；氧化偶氮甲烷；葡聚糖硫酸钠

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是临床难治性疾病之一，其症状反复，迁延难愈。UC及其相关性结直肠癌的发病率逐年上升，据统计，UC相关性结肠癌占所有结肠癌的l%～2%，但是却占了UC病人死亡原因的15%[1]。UC与结肠癌之间存在的因果关系已得到消化界公认，因此控制炎症的发生、发展对于肿瘤的防治显然是有利的[2-4]。笔者采取改良氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（azoxymethane，AOM/ dextran sodium sulfate，DSS）化学诱导方法构建溃疡性结肠炎癌变大鼠模型，观察自拟中药方肠愈宁对大鼠溃疡性结肠炎癌变的防治作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠60只，5周龄，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物合格证号：2007000567215。随机分成空白组、模型组、美沙拉嗪组、肠愈宁低、中、高剂量组6组，每组10只。饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心。22℃±1℃恒温，50%±10%恒湿饲养，保持光照/黑暗时间，每12h一循环。适应性饲养1周。

1.2 药物与试剂 美沙拉嗪缓释颗粒（商品名：艾迪莎）。自拟中药方肠愈宁组成：红藤、蒲公英、败酱草、马齿苋各30g，山慈菇15g，蛇六谷10g（先煎），香茶菜30g，炒黄连6g，生地榆30g，槐米、槟榔、炒枳壳、厚朴各10g，炒木香6g，委托浙江省中医院制剂中心制备成水煎剂。氧化偶氮甲烷：美国Sigma公司，货号A5486-100MG。葡聚糖硫酸钠盐：MP Biomedicals公司，货号0216011090，分子量36 000～50 000da。浓缩型DAB试剂盒（ZLI-9032）：批号60882801，北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 造模方法 模型组、美沙拉嗪组、肠愈宁低、中、高剂量组先腹腔注射AOM 10mg/kg，浓度为2mg/ mL，1周后开始自由饮用3%DSS溶液，饮用共14天，此为一个循环，连续3个循环。空白组自由饮水进食，不作其他处理。

1.4 给药方法 肠愈宁低、中、高剂量组和美沙拉嗪组在造模开始第一天即开始灌胃给药，1天1次，连续9周。等效剂量以成人常规剂量按人与大鼠体表面积系数折算，中药生药量为32g/kg。大鼠低、中、高剂量按等效剂量的0.5、1、2倍计算，即16g/kg、32g/ kg、64g/kg，以上均为生药量。美沙拉嗪缓释颗粒用量亦取等效剂量，即189mg/kg。空白组和模型组给予等效剂量蒸馏水灌胃。

1.5 取材及组织处理 10周末麻醉处死大鼠，充分暴露腹腔，沿矢状面纵行剖开，分离肛门至回盲部连接处整段结肠。用生理盐水漂洗结肠组织，观察全结肠黏膜的大体形态。于病变处剪取约1cm长组织条，置于10%多聚甲醛溶液中固定24h。置于包埋盒内，流水冲洗4h，然后将标本经升浓度梯度的乙醇脱水。脱水后，将组织浸入二甲苯溶液中透明，石蜡包埋组织块。连续切片，厚度为3μm，裱于载物片上，烘干，备用。

1.6 观察检测指标

1.6.1 大鼠一般情况及疾病活动度指数 记录实验前后大鼠体质量变化值，观察大鼠进食、饮水、活动、体毛、大便性状、直肠黏膜脱垂等情况。疾病活动度指数（disease activity index，DAI）参照Cooper等[5]的评分标准作适当修改，见表1。

表1 DAI评分标准

1.6.2 结肠大体形态观察 观察结肠长度、肠壁外观、血管网络清晰度及有无炎症、溃疡、瘤样凸起等。结肠大体形态损伤评分[6]见表2。

1.6.3 光镜下观察结肠黏膜病理形态学变化 结肠黏膜经苏木素-伊红染色（HE染色）后，作组织学损伤评分[6]，评分标准见表3。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件分析处理，检验资料方差齐性。计量资料以均数±标准差（±s） 表示。数据均为正态分布，若方差齐性，采用单因素方差分析，LSD检验进行两两比较，若方差不齐，采用单因素方差分析Dunnett’s T3检验进行两两比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

表2 结肠大体形态损伤评分标准

表3 结肠组织学损伤评分标准

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 治疗期间各组大鼠无死亡。空白组大鼠食欲良好，饮水适度，反应敏捷，大便为颗粒状，无肉眼血便或脱肛现象。在每一个循环后，体质量随饲养时间延长明显增加。模型组大鼠饮用DSS后出现便次增多、糊状便，症状逐步加重，甚者出现肉眼血便、脱肛，期间大鼠精神萎靡、反应迟钝、体毛凌乱黯淡，饮水量明显增多。改为普通饮水后，一般状态及大便性状逐渐恢复。再次饮用DSS后又表现为肠炎症状，恢复普通饮水后大便性状恢复的时间延后。体质量增加减缓。肠愈宁低、中、高剂量组和美沙拉嗪组大鼠第一循环出现与模型组类似的症状，但便血、脱肛的数量较少，改为普通饮水后大便性状恢复的较模型组快。第二、三循环肠炎表现较模型组轻。

2.2 疾病活动度指数（DAI） 造模前各组大鼠综合DAI评分均为0分。实验末处死大鼠前各组DAI评分见表4。模型组、肠愈宁低、中、高剂量组、美沙拉嗪组，与空白组比较，P＜0.05。肠愈宁低、中、高剂量组、美沙拉嗪组，与模型组比较，P＜0.05。而肠愈宁低、中、高剂量组与美沙拉嗪组之间无明显差异，P＞0.05。

2.3 结肠大体形态评分比较 模型组、美沙拉嗪组、肠愈宁低、中、高剂量组，与空白组比较，P＜0.05。美沙拉嗪组、低、中、高剂量组，与模型组比较，P＜0.05。见表4。

2.4 组织病理学观察 各组异型增生数模型组6只，美沙拉嗪组5只，肠愈宁低剂量组2只，中剂量组4只，高剂量组6只，空白组0只。经Fisher精确检验，P=0.019，P＜0.05。各组异型增生例数差异有统计学意义。各组结肠组织学损伤评分比较，模型组、肠愈宁中、高剂量组、美沙拉嗪组，与空白组比较，P＜0.05。低剂量组与模型组比较，P＜0.05。各组HE染色病理图片见图1（封四）。

表4 各组大鼠各项评分比较（分±s）

表4 各组大鼠各项评分比较（分±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；DAI：疾病活动度指数

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3 讨论

AOM/DSS模型是目前使用最广泛的UC化学诱导模型[7]。临床症状学、形态学及病理学观察证明，该模型与人类溃疡性结肠炎癌变过程极为相似。AOM引起鸟嘌呤O6甲基化是诱导基因突变损伤最主要的原因[8]。基因突变使细胞过度增殖，形成特异性的大肠肿瘤。DSS的致炎机制尚未阐明，可能与DSS的负电荷影响DNA合成、抑制上皮细胞增生、破坏肠黏膜屏障、导致巨噬细胞功能障碍及肠道菌群失调有关[9]。从大量文献数据来看，AOM/DSS模型成瘤率与AOM剂量、DSS浓度和老鼠品系相关，且有明显的时间依赖性。根据文献可见，基于该模型平台，在实验第9周时，已出现重度异型增生或癌变，且成瘤率较高，故本研究将造模时间点也定在9周[10-11]。

本实验中，模型组大鼠在饮用3%DSS的第二天即出现大便性状改变，逐步出现精神萎靡、饮水增多、体质量增长缓慢等情况，从实验大鼠的这些临床反应可见，该造模方法很好的模拟了人类溃疡性结肠炎的临床状态。10周末解剖大鼠，观察结肠见明显炎症表现：结肠长度明显缩短，管壁颜色紫黯，管壁增厚、僵硬、瘀曲，管腔狭窄，黏膜质脆易出血，血管增粗、模糊、色黯，部分见溃疡样改变。结肠黏膜局部呈串珠样瘤样凸起，周围黏膜苍白、干燥。病理切片显示呈不同程度的异型增生，甚至腺瘤及癌样改变。

本研究显示，模型组一般状态最差，腹泻、血便、脱肛严重，其他各组经过治疗后，一般状态相对模型组有改善，腹泻、血便等症状减轻，说明中药方肠愈宁及西药美沙拉嗪的治疗对UC大鼠临床症状的改善可能有效。低剂量组在DAI评分、结肠大体形态评分、结肠组织学损伤评分等方面均与模型组有显著差异，P＜0.05。说明自拟中药方肠愈宁有改善UC大鼠疾病活动度的作用，减轻炎症，改善临床症状，并且可减少溃疡形成、减轻黏膜出血、减少瘤样组织形成，从而抑制溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜向不典型增生及癌变的转变。

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（收稿：2015-04-10 修回：2015-06-12）

Effect of Chinese Medicine Changyuning on Ulcerative Colitis and Canceration

XU Fangfang1,MA Weiming1, GAO Zhibin1,KANG Niansong2. 1 Yuyao People's Hospital,Yuyao(315400),China;2 Department of Science and Education,Yuyao TCM Hospital,Yuyao(315400),China

Objective To investigate the prevention and treatment effect of TCM Changyuning on ulcerative colitis and canceration.Methods Sixty healthy SD rats were randomized into 6 groups:blank control group,model group,mesalazine group,and Changyuning groups（low,middle,and high doses）,with 10 rats in each group.A zoxymethane（AOM）and dextran sodium sulfate（DSS）were used to establish rat models of ulcerative colitis canceration.Rats in blank control group and model group were given distilled water and the rests were given the corresponding drugs by gavage once a day on the first day of modeling for continuous 9 weeks.General situation, stool,and daily weight of rats were observed and recorded,then at the end of the experiment rats were sacrificed to observe the morphology of colon and the histopathological change of colon by HE staining.Results ①General morphology of the model group conforms to the manifestations of ulcerative colitis and cancaration;②Significant difference in DAI score was found between control group and model,mesalazine,high-,middle-,and low-dose of Changyuning groups（0.50±0.53 vs 7.10±0.99,5.60±0.97,5.20±2.25,3.30±2.06,3.60±1.89,P＜0.05）and between model group and mesalazine,high-,middle-,and low-dose of Changyuning groups（P＜0.05）;③The morphology score was different between blank control group and model,mesalazine,high-,middle-,and low-dose of Changyuning groups（0.10±0.32 vs 4.30±0.95,3.10±0.99,3.10±1.10,2.80±1.14,2.20±0.63,P＜0.05）and between model group and mesalazine,high-,middle-,and low-dose of Changyuning groups（P＜0.05）;④The colon-histopathological score differed between blank control group and model,mesalazine,high-,and middle-dose of Changyuning groups（0.10±0.32 vs 3.90±0.88,3.40±1.89,3.00±1.89,P＜0.05）and between model group and lowdose of Changyuning group（3.90±0.88 vs 1.70±1.49,P＜0.05）.Conclusion Chinese medicine Changyuning can obviously relieve the clinical symptoms of rats with ulcerative colitis and canceration,improve histological change of the colon,and reduce the risk of canceration.

rats;ulcerative colitis;cancaration;Chinese medicine;azoxymethane;dextran sodium sulfate

1浙江省余姚市人民医院中医科（徐芳芳、马伟明）、病理科（高志斌）（余姚 315400）；2浙江省余姚市中医医院科教科（余姚315400）

徐芳芳，Tel：13738590900