鸡心包积液综合征（安卡拉病）病原分离检测

常维山 王涛

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAV）是一种无囊膜的双链DNA病毒，衣壳呈规则的20面体结构，直径约80～110nm，可分为I，Ⅱ，Ⅲ三群，其中I群FAV有12个血清型（FAVI～12），I群FAV具有共同的群抗原，比较著名的病毒株有鸡包涵体肝炎病毒，胚致死孤儿病毒（CEIO virus）等，产蛋下降综合征病毒属于Ⅲ群，其中I群FAV中C种FAV-4型认为是引起鸡心包积液综合征的病原。本病对3～6周龄肉仔鸡易感，潜伏期短、发病快。感染鸡群突然出现大批死亡，剖检发现心包积水、肝细胞有嗜碱性核内包涵体，以及用透射电镜在感染的肝细胞核内观察到有腺病毒颗粒。本实验采取病死鸡肝、心、肾脏进行病理组织学观察，可见形状不规则的嗜酸性或嗜碱性包涵体。同时取疑似鸡心包积液综合征病死鸡的肝组织粗提DNA，设计引物对DNA进行PCR扩增和基因测序分析，同时最后接种雏鸡，雏鸡一周后出现死亡，用相同方法获取组织DNA后进行PCR检测，可发现相同条带，表明成功建立鸡心包积液综合征（安卡拉病）病原分离检测方法。

1 流行病学

本病主要开始发生于1～3周龄的肉鸡、817、麻鸡，也可见于肉种鸡和蛋鸡，其中以3-7周龄的鸡发病较多。因首次发现于巴基斯坦卡拉奇靠近安卡拉的地方，故又名安卡拉病（Angrara disease）。发病鸡群多于3周龄开始死亡，4～5周龄达高峰，高峰持续期4～8d，5～6周龄死亡减少。病程8～15d，死亡率达20%-80%，一般在30%左右。发病鸡无明显先兆而突然倒地，沉郁，羽毛成束，出现呼吸道症状，甩鼻、呼吸加快，排黄色稀粪，有神经症状，两腿划空。本病主要垂直传播，也可水平传播。鸡感染后可成为终身带毒者，并可间歇性排毒。

2 解剖及病理组织检测

心臟部位形成淡黄色透明的心包积液，且肝脏有病理坏死现象（见P93，图1）。

采集发病活鸡肝心肾组织器官，经4%甲醛固定后制作石蜡切片，观察病理组织学变化，主要病理组织学变化表现在肝脏，可见肝脏充血、出血和肝细胞脂肪变性，肝细胞核内可见形状不规则的嗜酸性或嗜碱性包涵体（见P93，如图2）。

3 病原PCR检测

3.1 引物设计与合成

根据Genbank中I群禽腺病毒FAV-4型（AY581297.1）六邻体基因序列，应用Premier5.0设计FAV-4型引物（由上海生工公司合成）。本实验中所使用的引物（见表1）。

3.2 病原DNA的提取及PCR扩增

准备2个灭菌1.5mL EP管，每管按1：1加肝组织匀浆与灭菌ddH20，8000r/min离心4min收集上清液，按1：1加入分析纯氯仿静置10min后8000r/min离心5min，吸取上清液直接PCR，采用 25μL PCR体系：DNA样本1μL；10×PCRBuffer（Mg2+add）2.5μL；dNTP（2.5μmoVL）2μL；引物F/R各0.5μL；Taq酶（5U/μL）0.5μL；灭菌ddH₂018μL。

Buffer、dNTP、Taq酶均购自全式金，94℃5min；94℃45s变性；57℃45s；72℃45s，35个循环扩增；72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后取全部PCR产物25μL、Trans 2000 DNA marker对照，0.8%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小（图3）。

3.3 PCR产物序列测定

25μL体系PCR后0.8%琼脂糖凝胶中空胶电泳，将目的条带切胶回收后与pMD18-T载体（购自Takara公司）进行连接，连接体系：目的条带5μL；solution I 4.2μL；T载体0.8μL。

16℃于PCR仪中连接30min，然后将连接产物10μL转化进50μL的Transl-T1感受态细胞（购自Trans），冰浴30 min后热激90s，紧接冷敷3min，加800μLLB震荡培养th后6000r/min离心1min沉淀菌体，留100μL菌液涂布于Amp抗性的平板中37℃培养10h，挑取单菌落接种于Amp抗性的5mL LB液体试管培养基后37℃震荡培养过夜（220rpm/min），然后将菌液送生工公司测序，测序结果应用DNA star软件MegAlign的Clustal W方法与FAV-4基因进行序列比对，在送测序列中发现和295bp扩增目的片段一致的序列，表明于病鸡肝脏成功检测到FAV-4型腺病毒。

3.4 病原接种试验

将病理肝组织与灭菌生理盐水匀浆搅匀后给雏鸡口服0.5mL匀浆液，此后于37℃恒温饲养，雏鸡一周后出现死亡，取死亡鸡肝脏组织用以上相同方法获取组织DNA后进行PCR检测，可发现相同条带（如图4）。