壮族家系显性视网膜色素变性RHO基因的突变筛查

覃莉等、

【摘要】目的探讨一壮族常染色体显性遗传（ADRP）视网膜色素变性（RP）家系视紫红质（RHO）基因第58、347密码子是否存在突变。 方法采集一连续4代发病的壮族ADRP家系29名成员外周血DNA，应用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性法对RHO基因的上述密码子进行检测。结果RHO基因第58、347密码子在该壮族家系中未发现突变。结论该壮族家系ADRP发病与RHO基因第58、347密码子不相关，其发病的分子遗传学机制有待进一步研究。

【关键词】视网膜色素变性；常染色体显性遗传；RHO基因；限制性片段长度多态性

中图分类号：R774.1 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.04.003

【Abstract】ObjectiveTo investigate whether mutation existed in codon 58 and codon 347 of rhodopsin （RHO） gene of retinitis pigmentosa （RP）in a Zhuang family with autosomal dominant retinitis pigmentosa （ADRP）.MethodsPeripheral blood DNA of 29 members was collected from a Zhuang family whose four generations had suffered from ADRP.Polymerase chain reaction （PCR）―Restriction fragment length polymorphism （RFLP） was applied to detect the codon 58 and codon 347 of RHO gene.Results No mutations were found in the codon 58 and codon 347 of RHO gene in this family.ConclusionThere is no relation between the morbidity of ADRP and the codon 58 and codon 347 of RHO gene in the Zhuang family.And further research is needed to be carried out on the molecular genetic mechanism of its onset.

【Key words】RP；ADRP；RHO gene；RFLP

视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是一组以视网膜感光细胞和色素上皮进行性受损为主要特征的遗传性眼病。我国的平均患病率约为 1/3784[1]，其遗传方式主要为常染色体显性遗传（autosomal dominant RP，ADRP）、常染色体隐性遗传（autosomal recessive RP，ARRP）、X染色体连锁遗传（Xlinked RP，XLRP）和双基因遗传。迄今为止，视紫红质（rhodopsin，RHO）基因突变引起的ADRP为265%，我国 ADRP 患者约有 7%由此基因引起[2]，是ADRP基因中突变率最高的，故RHO成为ADRP分子缺陷研究的第一候选基因。本研究对广西一ADRP壮族家系RHO基因Exon 1、5外显子的第58、347密码子是否存在与发病关联的突变进行初步筛查。

1对象与方法1.1对象 研究家系来自广西壮族自治区贵港市。询问家系成员病史并绘制家系图谱（见图1）。采集10例患者（男6例、女4例）和19例正常成员的外周血。所有研究对象均进行常规体检及眼部检查（包括视力、眼底、眼压等）。 图1 壮族ADRP家系系谱图。

1.2方法

1.2.1外周血DNA制备采集该家系中10例患者、19名正常成员静脉血2 ml， 加ACD抗凝，用经典的苯酚/氯仿法提取白细胞DNA，TE缓冲液溶解，置4℃备用。

1.2.2引物设计及PCR扩增 参照文献[3]设计引物，扩增RHO基因Exon 1、5的部分片段，由上海生物工程公司合成2对引物（见表1）。PCR扩增反应体系（30 μl）：模板DNA 1 μl，正反向引物各1 μl，Taq酶0.1 μl（5 U/μl），dNTP 3 μl（2.5 mmol/L），10×buffer（Mg2+）4 μl，无菌注射用水19.9 μl。反应过程分3个阶段：第1阶段，95℃预变性 5 min；第2阶段，以 93℃变性1 min，54.5℃退火 1 min，71℃延伸 100 s，为 1个循环，共30个循环；第3阶段，71℃再延伸 5 min，8℃保存备用。取5 μl PCR扩增产物，在1.5%琼脂糖凝胶，用电压100 V，电流150 mA电泳40～50 min，紫外光透射仪上观察并拍摄DNA带纹，证实PCR扩增片段存在。

1.2.3限制性片段长度多态性（RELP）PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认后，各取10 μl分别加0.5（10 U/μl）DdeI， 1 μl（10 U/μl）MspI，37℃恒温水浴中消化过夜，消化产物于12%聚丙酰胺凝胶90 V恒电压下电泳1.5小时，EB染色20分钟，紫外光透射仪上观察并拍摄DNA带纹。

2结果2.1琼脂糖凝胶电泳分析结果家系中患者和正常成员的RHO基因PCR扩增产物为Exon 1基因片段360 bp；、Exon 5基因片段277 bp（见图2、图3）。

2.2限制性内切酶酶切电泳分析结果DdeI酶切Exon 1片段的消化产物电泳后呈现310 bp和50 bp DNA条带两个（见图4）。MspI酶消化Exon 5片段后电泳可见56、100、121 bp三个DNA带型格局（见图5）。

3讨论根据RP诊断标准，该家系4代，每代可见患者，男女发病率之比为8∶5，近似于1∶1，双亲无病的子女不患病，29名成员中10例被确诊为ADRP患者。该家系患者中，夜盲为始发症状，渐出现视野缩小，视力减退，累及双眼至最终双眼的视力无光感，提示症状随着年龄增长而逐渐加重。该家系的临床表型特点为：发病时间年龄差异大，第Ⅰ～Ⅲ代较晚（30～40岁左右），第Ⅳ代目前只有Ⅳ4（10岁左右）表现出RP的临床症状。家系中Ⅱ11（72岁）、Ⅱ13（76岁）、Ⅲ22（43岁）、Ⅲ31（46岁）双眼已无光感，前3名患者及先症者Ⅱ7（75岁）合并青光眼，Ⅲ31合并白内障。家系不同患者间的临床表现存在差异，显示表型异质性。

ADRP最常见的致病基因RHO基因迄今已发现100 余种[4]突变与ADRP有关，其中 90%以上的突变表现为无义或错义突变，少数为微小缺失或插入突变。这些突变中，Pro23His 和 Pro347Leu 在欧美最为常见，我国以 Pro347 Leu 突变[5]为主，亦有第58密码子突变的发现[6]，Pro 23 His突变尚未发现。因此本研究首先选取RHO基因Exon 1、5外显子的第58、347密码子进行突变筛查。

本研究应用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性法分析RHO基因Exon 1、5外显子的第58、347密码子。DdeI酶在Exon 1片段内有一个切点，该片段DdeI消化产物电泳后呈现310 bp和50 bp DNA条带两个。若第58密码子发生C→G的点突变时则出现新的DdeI酶切识别位点，致新的酶切片段产生[3]。本研究所检测的RP病例均呈现与正常对照相同的带型格局，提示第58密码子没有产生新的DdeI酶切识别位点。Exon 5片段内含有位于第314密码子和347密码子处的两个MspI酶切位点，故MspI消化正常人Exon 5片段后电泳可见3个DNA条带。若第347密码子发生点突变将使该处的识别位点丧失[3]。本研究所检测的RP病例均呈现与正常对照相同的56、100、121 bp三个DNA带型格局，提示该处保持原有的MspI酶切位点。综上所述患者与家系中的正常对照的扩增序列完全一致，排除在Exon 1、5外显子扩增区域内存在丢失缩短或插入延长及碱基突变的可能，表明RHO基因第58、347密码子不存在与该ADRP家系的相关突变。

壮族人群在遗传背景上表现为与汉族及周围群体有所不同的独特性[7～8]，不同地区、不同人群RHO基因突变存在差异性，且RP具有高度遗传异质性[9]，因此该壮族ADRP家系患者亦可能存在异于其他族群的RHO基因突变格局。我们下一步将应用HTCSGE技术和DNA直接测序方法对RHO基因5个外显子及其附近拼接序列进行突变筛查，探讨RHO基因与该壮族ADRP家系的关联性。参考文献[1] 覃泳杰，郭海科.常染色体遗传型视网膜色素变性相关基因的研究进展[J].眼科研究，2009，27（12）：11591163.

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（收稿日期：2015-05-31修回日期：2015-08-08）

（编辑：梁明佩）

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