桂西壮族散发性激素耐药型肾病综合征NPHS2基因多态性分析研究

覃幼玲等

【摘要】目的探讨桂西壮族散发性激素耐药型肾病综合征（SRNS）患者NPHS2基因突变及其特点。方法采用DNA序列直接测定法检测50例桂西壮族散发性SRNS患儿（观察组）血清NPHS2 基因全部外显子及其周围的部分内含子，并与30例健康青少年（对照组）进行比较。结果观察组NPHS2基因的8个外显子均未检测到错义突变，但检测到 3个NPHS2 基因多态性即288C>T、954C>T和1038A>G；观察组的基因型和等位基因频率与对照组分别进行比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论提示NPHS2基因多态可能不是桂西壮族散发性 SRNS 患儿的主要致病原因。

【关键词】NPHS2基因；激素耐药型肾病综合征；种族

中图分类号：R692 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.04.001

【Abstract】ObjectiveTo explore the mutation and characteristics of NPHS2 gene in patients with sporadic steroidresistant nephritic syndrome （SRNS） in Zhuang ethnic group in western Guangxi.MethodsDirect measurement of DNA sequence was applied to test all the exons and some surrounding introns of serum NPHS2 gene in 50 cases of children with sporadic SRNS （observation group），and then compared them with those of 30 healthy children （control group）.Results No missense mutation was found in the detection of the 8 exons of NPHS2 gene in the observation group，but 3 polymorphism of NPHS2 gene （288C>T，954C>T and 1038A>G） were found.The genotype and allele frequency of the observation group were compared with those of the control group respectively，difference was not statistically significant（P>0.05）.ConclusionThe results show that the mutation of NPHS2 gene may not be the main cause of sporadic SRNS in Zhuang ethic group in western Guangxi.

【Key words】NPHS2 gene；SRNS；ethnic group

原发性肾病综合征（PNS）是常见的肾小球疾病，大量蛋白尿是PNS的主要临床表现，也是肾脏病理不断进展的主要因素之一。PNS经足量糖皮质激素治疗4周无效应者称为激素耐药型肾病综合征（SRNS） [1]，临床上10%～20%的PNS患者对糖皮质激素耐药，逐渐发展为终末期肾病（ESRD）。随着分子生物学与遗传学研究的深入， NPHS2基因突变可引起散发性或家族性SRNS得到证实。目前，国际上散发性SRNS患儿NPHS2基因突变的研究已有报道，我国针对散发性SRNS患儿NPHS2基因突变的研究相对较少。本研究应用直接测序技术分析桂西壮族散发性SRNS患儿NPHS2基因突变及其特点。

1对象与方法1.1研究对象选择2011年5月～2013年5月收治于右江民族医学院附属医院肾内科的50例散发性SRNS患儿（观察组），男38例，女12例；年龄（12.13±3.68）岁。选择尿检正常的30 例健康桂西壮族青少年人群作为对照组，男19例，女11例；年龄（12.45±3.54）岁。本研究经医院伦理委员会批准，知情同意书由患儿家长签署。

1.2病例的入选和排除标准（1）发病年龄：3个月～18岁；（2）肾病综合征：大量蛋白尿（尿蛋白>35 g/L）、低白蛋白血症（血浆白蛋白≤30 g/L）、高脂血症（血浆胆固醇高于 5.7 mmol/L）、不同程度的水肿；（3）激素耐药为泼尼松1.5～2.0 mg·kg1·d1治疗4周后尿蛋白未转阴的患儿[1]；（4）籍贯为桂西地区，壮族，来自不同家族，父母非近亲结婚；（5）无肾脏疾病家族史。排除标准：（1）继发性肾病综合征：乙型肝炎病毒相关性肾炎、系统性红斑狼疮、过敏性紫癜肾炎等；（2）遗传性肾病。

1.3方法

1.3.1基因组DNA提取从外周静脉抽取研究对象的空腹血样5 ml，置于含有枸橼酸钠和EDTA抗凝试管中，应用北京天根生化科技有限公司提供的TIAN amp Blood DNA Kit（血液基因组DNA提取试剂盒），提取DNA的样品严格按照操作说明书进行，确保得到高质量的DNA样品，保存在-80℃的冰箱中备用。

1.3.2引物设计和合成从美国国立医学图书馆的国家生物计算信息中心的 Nucleotide 数据库获得的基因组序列和 NPHS2基因外显子序列（Gene Bank：NT_004487.17），应用引物设计软件 Primer 5设计扩增NPHS2 的8个外显子全部编码区及其周围的部分内含子区域，全部引物委托大连TaKaRa公司合成。NPHS2基因8个外显子的引物序列和PCR产物见表1。

1.3.3PCR扩增NPHS2的PCR扩增反应体系为25 μl，包括2 μl 的基因组DNA，2xTaq Platinum PCR Master Mix（其中NPHS2基因的1号外显子富含GC碱基，其为2xTaq GCrich PCR Master Mix）12.5 μl，ddH20为8.5 μl（由北京天根生化科技有限公司提供）。PCR循环条件：94℃预变性3 min后进入循环：变性94℃共30 s，退火温度50℃～62℃（退火温度根据各个引物的Tm值加以调整）30 s，72℃ 2 min（其中NPHS2基因的1号外显子高GC，其为72℃1 min），共30次循环。最后72℃延伸5 min。采用2%的琼脂糖凝胶鉴定扩增目的片段的大小。

1.3.4序列测定选择NPHS2基因外显子1～8号条带显示清晰的PCR产物，委托北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司，依据Sanger测序原理，DNA条带测序用ABI3730自动测序仪进行直接检测，再以Chromas软件打开测序文件并与DNA序列峰图对比，以峰图为准得出每例标本的序列，使用NCBI Blast 在线软件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi） 进行序列比对，当结果存在基因变异时，加测互补链确认基因变异，探寻NPHS2的基因突变点和单核苷酸多态性（SNPs）。

1.4统计学方法应用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，计数资料用百分数或频数表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果2.1NPHS2基因突变分析两组均未发现NPHS2基因的错义突变，其中19例SRNS患儿和4例健康青少年检测到NPHS2基因的3个单核苷酸多态性（ SNPs）， 分别为288C>T（4/50），954T>C（16/50）和1038A>G（10/50）。见图1。

2.2基因型与等位基因的频率两组的基因型和等位基因频率比较，差异均无统计学意义（P>005）。见表2。

改变的位置。

NPHS2突变可发生在 8 个外显子中的任何 1 个外显子或部分内含子，均为点突变，未发现热点突变，可导致散发性SRNS和家族性SRNS。NPHS2基因突变大多在儿童，成人期相对较少，年龄跨度较大，从新生儿期到36岁，绝大部分对激素治疗无效，免疫抑制剂疗效不佳，肾移植后复发率为8%[3～4]。肾脏病理多为局灶性节段性肾小球硬化（FSGS）和肾小球微小病变型（MCD），包含8 个外显子。

Santin 等[5]发现在 36 例SRNS患儿中有7例由NPHS1、NPHS2、CD2AP或 WT1 基因突变所致，检出率为19.4%。18例以色列阿拉伯的散发性SRNS患儿有6例存在NPHS2基因突变（412C>T），检出率为33.3%[6]。Lipska等[7]对德国227例青少年SRNS患者NPHS2筛查中发现有13%的染色体隐性遗传病例和6%的散发病例存在pococin蛋白。因此，国外的研究证实进行NPHS2基因检测已成为散发性青少年SRNS患者最合理和最有效的靶基因诊断方法之一。

国内学者Wu 等[8]率先在家族性SRNS发现了288C>T、954C>T 和1038A>G共3个SNP，随后这些位点陆续在欧洲、亚洲部分国家的散发性SRNS 患儿中检出。近年，虞萍等人[9]、王宪耀等[10]在中国南方汉族SRNS患儿中均未检测出NPHS2基因错义突变，在外显子1，2，8中也发现以上3个SNP位点，提示NPHS2基因突变可能不是中国南方、粤东地区儿童SRNS的致病因素之一。

本研究对50例广西桂西地区壮族SRNS患儿进行NPHS2基因变异检测，均未发现NPHS2突变基因，但19例SRNS患儿检测到NPHS2基因2号和8号外显子上的3个变异，即288C>T（S96S）、954C>T（A318A）和 1038A>G（L346L），这3个变异在30例对照组中亦有检出。同时本研究分别对两组间的基因型频率和等位基因频率进行了比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。有4例SRNS患儿同时检测到2个SNP，病理类型为MCD，这4名患儿的复发次数高于其他患儿，由于病例数较少，尚不能认定2个SNP（288C>T和1038A>G）的同时存在与SRNS患者MCD的病理类型和复发次数有相关性。

综上所述，在50例桂西地区壮族SRNS患儿中均未检测到NPHS2突变，但发现了 3 个NPHS2 基因多态性，提示桂西壮族散发性SRNS儿童的主要病因可能不是NPHS2 基因突变所致，检测出的3个SNP与其发病是否相关尚待进一步研究。参考文献[1] 中华医学会儿科学分会肾脏病学组.儿童常见肾脏疾病诊治循证指南（试行）（三）：激素耐药型肾病综合征诊治指南[J].中华儿科杂志，2010，48（1）：7275.

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[5] Fuchshuber A，Jean G，Gribouval O，et a1.Mapping a gene（SRNl）to chromosome 1q25q3l inidiopathic nephrotic syndrome confirms a distinct entity of autosomal recessive nephrosis[J].Hum Mol Genet，1995，4（11）：21552158.

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[7] Lipska BS，Iatropoulos P，Maranta R，et al.Genetic screening in adolescents with steroidresistant nephrotic syndrome[J].Kidney Int，2013，84（1）：206213.

[8] Wu MC，Wu JY，Lee CC，et al.A novel polymorphism （c288C>T） of the NPHS2 gene identified in a Taiwan Chinese family[J].Hum Mutat，2001，17（1）：8182.

[9] 虞萍，张瑶，陆婉维，等.激素耐药型肾病综合征患儿NPHS2基因多态性变异研究[J].实用儿科临床杂志，2012，27（23）：17951797.

[10] 王宪耀，綦巧雯，林浩铨，等.粤东地区散发性肾病综合征患儿 NPHS2基因多态性分析[J].分子诊断与治疗杂志，2013，5（2）：107110.