温经通络散对奥沙利铂所致周围神经毒性大鼠作用机制研究

王媛媛等

摘要：目的 探討温经通络散外用对奥沙利铂所致周围神经毒性大鼠的治疗作用及机制。方法 采用腹腔注射奥沙利铂4 mg/kg建立标准奥沙利铂周围神经毒性大鼠模型。将雌性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、中药组，中药组予温经通络散浸泡大鼠四肢及尾部，模型组大鼠予去离子水浸泡作为对照，正常组大鼠腹腔注射等体积5%葡萄糖。检测温度和机械刺激下大鼠痛觉超敏和过敏反应，采用免疫组化方法检测大鼠L4～L6段脊髓背角GFAP表达，RT-PCR检测大鼠L4～L6段背根神经节谷氨酸转运体1（GLT-1）mRNA表达。结果 模型组大鼠较正常组出现明显行为学改变（P<0.05），中药组大鼠较模型组行为学明显改善（P<0.01）；模型组大鼠GFAP阳性细胞数较正常组明显升高（P<0.05），中药组升高不明显；与正常组比较，模型组可见脊髓背角内星形胶质细胞胞体增大，突起增多、变粗及GLT-1 mRNA表达下降（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，中药组活性细胞减少、突起减少及GLT-1 mRNA表达水平升高（P<0.01）。结论 温经通络散外用可显著改善奥沙利铂所致的神经病理性疼痛。其作用机制可能与抑制脊髓背角星形胶质细胞活化进而介导的伤害性信号传递有关。

关键词：温经通络散；奥沙利铂；周围神经毒性；神经病理性疼痛；中医外治；行为学；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.020

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0070-04

Effects of Wenjing Tongluo Formula on GFAP Level in Perpheral Neuropathy Rats WANG Yuan-yuan1， JIA Li-qun2， DENG Bo2， ZHANG Hong-lei2， SONG Ai-ping2， DA Ji-ping2， YU Li-li2 （1.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；2.China-Japan Friendship Hospital， Beijing 100029， China）

Abstract：Objective To discuss the treatment action and mechanism of Wenjing Tongluo Formula on oxaliplatin-induced perpheral neurotoxicity in rats. Methods Intraperitoneal injection was used to inject oxaliplatin 4 mg/kg to establish oxaliplatin-induced peripheral neurotoxicity rat models. Female Wistar rats were randomly divided into normal group， model group， and TCM group. TCM group was given Wenjing Tongluo Formula to soak rats limbs and tails. Rats in the model group were soaked with deionized water for comparison. Rats in the normal group received intraperitoneal injection with 5% glucose. Algesia hypersensitivity and anaphylaxis were detected under the mechanical stimulation and temperature. Immunohistochemical method was used to detect the expression of GFAP in L4-L6 spinal dorsal horn of rats. Explore the level of GLT-1 in L4-L6 dorsal root ganglia by RT-PCR. Results Rats in model group showed obvious behavioral changes compared with normal group （P<0.05）；Rats in the TCM group improved in behavioristics compared with model group （P<0.01）；number of positive cells in GFAP of rats in the model group increased compared with normal group （P<0.05）；the increase in the TCM group was not obvious. Compared with normal group， astrocytes in spinal dorsal horn of model group were enlarged， protuberances increased， became coarse， and GLT-1 mRNA is decreased （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， active cells and protuberances in the TCM group decreased （P<0.01）， GLT-1 mRNA is increased （P<0.01）. Conclusion Wenjing Tongluo Formula can improve

基金项目：国家自然科学基金（81173421）

通讯作者：贾立群，E-mail：liqun-jia@hotmail.com

behavioral changes of model rats under temperature and mechanical stimulation， probably related to harmful signal transmission induced by inhibition of astrocyte in spinal dorsal horn.

Key words：Wenjing Tongluo；oxaliplatin Formula；peripheral neurotoxicity；neuropathic pain；TCM external treatment；behavioristics；rats

肿瘤治疗过程中，由化疗药物所引起的神经病理性疼痛为临床常见的不良反应。奥沙利铂是晚期大肠癌一、二线治疗药物，其对胃癌、卵巢癌、乳腺癌等均有效。随着奥沙利铂在临床上的广泛应用，其导致的以感觉神经障碍为特点的周围神经毒性成为目前国内外肿瘤领域的研究重点之一[1]。本课题组前期临床研究结果显示，温经通络散外用治疗化疗引起的周围神经毒性疗效较好[2-3]。本研究通过复制奥沙利铂周围神经毒性大鼠模型，探讨温经通络散的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雌性Wistar大鼠45只，体质量（210±10）g，8周龄，均购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK（京）2014-0004。

1.2 药物

温经通络散配方颗粒（老鹳草、川乌、红花、桂枝等，中日友好医院药学部提供），用时取100 g颗粒溶于1000 mL去离子水中制成浸剂。奥沙利铂（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号13081211），50 mg溶解于5%葡萄糖溶液，终浓度1 mg/mL，4 ℃保存备用。透皮剂月桂氮酮（Azone，国药集团化学试剂有限公司，批号2013z16）。

1.3 主要仪器与试剂

Von Frey纤维丝（North Coast Medical），丙酮（北京化工厂），BX51正置光学显微镜（OLYMPUS）。通用型二抗（DAKO），Trizol（Invitrogen公司），多克隆兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（万类生物），7500 RT-PCR仪（Applied Biosystems、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit BX51），Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）。

2 实验方法

2.1 造模、分组与给药

大鼠随机分为正常组、模型组、中药组，每组15只。参照文献[4]腹腔注射奥沙利铂4 mg/kg，每周2次（分别于第1、2、8、9、15、16、22、23日注射），连续4周，建立周围神经毒性大鼠模型。造模第8日始，将温经通络散浸剂加入1%月桂氮酮，浸泡大鼠四肢和尾部，每日2次，每次30 min，共23 d；模型组予常温去离水加入1%月桂氮酮浸泡大鼠四肢和尾部[5]，正常组腹腔注射等体积5%葡萄糖。

2.2 行为学检测

2.2.1 机械性痛觉过敏和超敏测试 将大鼠置于金属网上，盖以透明有机玻璃罩（23 cm×17 cm×13 cm），测试之前让大鼠适应环境15 min，待梳理探究活动基本消失后，分别采用4、15 g Von-Frey纤维丝刺激大鼠后肢足底，每侧足底测量5次，2次刺激间隔6 s以上，大鼠在刺激时间内或在移开纤维时立即出现快速的抬足反应记为阳性反应，而身体活动所引起的抬足反应不记为阳性反应。测试时记录双后肢抬足次数，并计算缩足百分率（阳性反应次数÷10×100%[8]）。Von Frey纤维4 g刺激大鼠足底出现抬足反应为机械刺激痛觉超敏反应，Von Frey纤维15 g刺激大鼠足底出现抬足反应为机械刺激痛觉过敏反应。行为学检测均于给药后1 h进行[6-7]。

2.2.2 冷刺激过敏反应测定 参照文献[9]中丙酮喷洒的方法进行大鼠冷刺激过敏反应的检测，大鼠置于金属网上，盖以透明的有机玻璃罩，测试之前先让大鼠适应环境15 min，待梳理探究活动基本消失后，将50 μL丙酮喷洒在大鼠后爪表面皮肤上，以丙酮开始喷洒时为0时，计时40 s，统计大鼠40 s内缩足次数。左右各3次，共计6次。

2.3 大鼠脊髓背角胶质纤维酸性蛋白表达检测

大鼠于末次给药后24 h，0.9%戊巴比妥麻醉后取材。取L4～L6段脊髓，置于中性福尔马林中固定48 h后进行脱水、石蜡包埋，沿纵轴最大纵切面连续5 μm厚切片18张。然后进行脊髓切片的GFAP免疫组化染色分析。BX51正置光学显微镜下每张切片随机取5个视野，Image Pro-Plus 5.0图像分析软件计数GFAP阳性细胞数。

2.4 RT-PCR检测大鼠背根神经节谷氨酸转运体1 基因表达

实验结束时，取大鼠双侧L4～L6背根神经节，分离后迅速移至-80 ℃保存。Trizol法抽提RNA，取2 μg RNA用于合成cDNA。PCR引物序列：正向5-GCTGCT GGATAGAATGAGAACTTCGG-3（26 bp）、反向5-TTCCAA GGTTCTTCCTCAACACTGC-3（25 bp）。RT-PCR反應：95 ℃、10 min进行预变性，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，扩增40个循环。结果采用ΔΔCt法进行分析。

3 统计学方法

采用SPSS19.0統计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，方差不齐采用Kruskal- Wallis H检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 不同时点温经通络散对大鼠机械性痛觉超敏和过敏的影响

注射奥沙利铂后，行为学检测结果显示，模型组、中药组大鼠较正常组出现明显的机械性痛觉超敏和过敏反应；给药7 d后，中药组大鼠痛觉超敏和过敏反应较模型组明显减轻，缩足百分率降低，且第23、30日行为学检测中均低于模型组。结果见表1、表2。

4.2 不同时点温经通络散对大鼠冷刺激过敏的影响

第3次注射奥沙利铂后，模型组、中药组与正常组比较，出现丙酮刺激后缩足反射次数明显增多，以抬足、甩足、舔足为表现，并持续至第30日。中药组大鼠冷刺激引起的感觉过敏反应自给药第7日开始下降，直至第30日。结果见表3。

4.3 温经通络散对大鼠脊髓背角胶质纤维酸性蛋白表达的影响

正常组大鼠双侧脊髓背角GFAP均正常少量表达，细胞胞体不明显，染色较浅，星形胶质细胞处于静息状态；与正常组比较，模型组可见脊髓背角内星形胶质细胞胞体增大，突起增多、变粗及GFAP阳性细胞明显增多（P<0.01）；与模型组比较，中药组活性细胞减少、突起减少（P<0.01）。结果见图1、表4。

4.4 温经通络散对大鼠背根神经节谷氨酸转运体1基因表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠背根神经节谷氨酸转运体1（GLT-1）mRNA表达明显降低（P<0.05）；与模型组比较，中药组大鼠GLT-1 mRNA表达明显升高（P<0.01）。结果见表5。

5 讨论

目前研究表明，星形胶质细胞的激活及激活后产生的各种致痛物质是神经病理性疼痛发生和维持的必要条件[10-12]。GFAP是星形胶质细胞特有的一种中间丝蛋白，被作为星形胶质细胞活性状态的标志之一而被广泛使用[13]。国外研究发现，奥沙利铂周围神经毒性模型脊髓背角GFAP呈现高表达状态[14-16]，提示奥沙利铂周围神经毒性导致的神经病理性疼痛的发生、维持与星形胶质细胞活化、增多有关。

本研究结果表明，模型组大鼠脊髓背角星形胶质细胞较正常组胞体增大，突起增多、变粗，差异显著，与文献报道一致。表明星形胶质细胞的确参与了奥沙利铂周围神经毒性的调控。胶质细胞包绕中枢神经系统中的突触、表达多种神经递质及其受体，如P物质、降钙素基因相关肽（CGRP）、谷氨酸等[17]，在化疗引起周围神经毒性大鼠模型中发现，注射奥沙利铂24 h后，P物质在大鼠脊髓背角大量表达[18]；同时P物质和CGRP与慢性神经病理性疼痛的持续状态高度相关[17-19]。这提示，增殖活化的星形胶质细胞通过上述物质参与着奥沙利铂所致神经病理性疼痛的调节机制。

谷氨酸是神经系统主要的兴奋性神经递质，参与疼痛信息的传递。神经损伤后，感觉传入纤维谷氨酸和天冬氨酸释放增加，过度激活中枢神经谷氨酸受体，导致中枢神经系统内神经元兴奋性增强，并激活胶质细胞。突触间隙内谷氨酸的重摄取主要依赖于兴奋性谷氨酸转运体（EAATs）的含量，而EAATs表达在神经损伤或其他致病因素影响下发生改变。本实验中EAATs家族中GLT-1在模型组大鼠背根神经节中显著降低，即可能是奥沙利铂导致了突触间隙内谷氨酸的增多，产生兴奋性氨基酸毒性作用，致中枢敏化、脊髓星形胶质细胞被激活。

本研究结果表明，奥沙利铂可诱发大鼠神经病理性疼痛，表现为机械性刺激的痛觉过敏、痛觉超敏和冷刺激引发的痛觉过敏，与文献报道一致[6，20]。温经通络散外用第7日开始，中药组大鼠50%缩足阈较模型组明显升高，直至第30日，与模型组比较差异有统计学意义，表明温经通络散外用可显著改善奥沙利铂所致的神经病理性疼痛。其作用机制可能与抑制脊髓背角星形胶质细胞活化进而介导的伤害性信号传递有关。

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（收稿日期：2014-09-12；編辑：华强）