一例I型鸭病毒性肝炎及其高免卵黄抗体的制备

王蕾 刘玉庆 宋道祯 付石军 常维山

摘  要：对山东省蒙阴县某疑似鸭肝炎发病鸭肝脏进行超薄片电镜观察，发现两种不同的病毒颗粒，RT-PCR鉴定，确诊发病鸭为I型鸭病毒性肝炎和禽流感混合感染。用该鸭肝炎毒株接种易感雏鸭，取病死鸭肝脏，制备组织灭活苗，并加以不同的疫苗佐剂，设置蜂胶组、黄芪组及不加佐剂的对照组三组。按照免疫程序免疫高产蛋鸡，收集高免蛋。通过中和试验对三组卵黄抗体的效价进行了测定，选择效价较高的卵黄抗体将其应用于临床发病雏鸭的治疗。

关键词：鸭病毒性肝炎;混合感染;卵黄抗体

中图分类号：S858.325.3     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2015）06-0013-04

鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis，DVH）是由鸭肝炎病毒（DHV）引起雏鸭的一种高度致死性、急性传染病，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。本病多发生于3周龄内的雏鸭，1周龄左右的雏鸭最易发生。病死鸭多呈角弓反张样外观，其肝脏常有特征性的出血性病变，以肝炎为其主要特征。2014年3月，山东蒙阴某肉鸭场7日龄雏鸭出现大批死亡，病死率高达80%，病死鸭呈现角弓反张，剖检可见肝脏明显的出血点。

1  材料

1.1  病料来源  山东蒙阴县疑似鸭肝炎病死雏鸭肝脏。

1.2  主要试剂  反转录酶（M-MLV），Promega公司生产;反转录酶抑制剂（RNase Inhibitor）、dNTP、rTaq DNA聚合酶、DNA marker，TaKaRa公司生产;Trizol，invitrogen公司生产。

2  方法

2.1  肝组织电镜标本制备及观察  取活的发病雏鸭的肝脏切成小薄片，存放于盛有2.5% 戊二醛的瓶中，4℃冰箱固定2h以上。取出切片0.1M磷酸缓冲液进行漂洗，漂洗3次，每次45min。用1%锇酸进行后固定，1h左右，再漂洗。脱水、包埋聚合后制成超薄切片，用饱和醋酸铀染色30min，柠檬酸铅染色5～8min。H-7000型透射电子显微镜对肝脏超薄片进行观察。

2.2  鸡胚半数致死量测定（ELD50）  将病料加生理盐水匀浆后取上清，反复冻融3次，用0.22μm微孔滤膜过滤，0.2ml/胚经尿囊腔接种到9日龄的鸡胚5枚，另取2枚鸡胚接种灭菌生理盐水0.2ml/胚作对照，置37℃温箱培养，并逐日观察记录结果，收集死亡鸡胚尿囊液。

将有明显病变的尿囊液用双抗生理盐水进行10倍连续稀释，然后用孔径为0.22μm的一次性滤器过滤，分别取10-2～10-8 7个稀释梯度的病毒液接种到9日龄的鸡胚尿囊腔中，0.2ml/胚，每个梯度接种5个鸡胚，封口，并做好标记，在37℃的温箱中孵化，每12h照一次鸡胚，24h内死亡的鸡胚弃掉，记录5d内胚胎死亡时间及数量。根据Reed-Muench公式计算鸡胚半数致死量ELD50。

2.3  混合感染的RT-PCR诊断

2.3.1  引物设计  根据Genbank已发表的 DHV-I 基因组序列和禽流感病毒核蛋白基因（NP）序列，利用DNAstar生物学软件设计合成并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成两对鉴定引物，引物序列为：

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2.3.2  病毒RNA的提取  参照Trizol法提取，按照试剂说明书进行。

2.3.3  RT-PCR反应  反转录反应按20μl体系进行，反应条件为42℃ 20min，85℃ 5s。

PCR扩增反应以25μl反应体系进行：10×Buffer缓冲液2.0μl，dNTP 2.0μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板1μl，rTaqDNA 聚合酶0.5μl，加水至25μl。

鸭肝炎病毒RT-PCR反应程序为：先94℃4min预变性，再进行94℃ 45s，54℃ 45s，72℃ 45s 的反应循环，共30个循环，最后72℃延伸10min，于4℃结束反应。

禽流感病毒PCR反应条件为：先94℃ 5min 预变性，再进行94℃ 1min，54℃ 45s，72℃ 45s 的反应循环，共30个循环，最后72℃延伸10min，于4℃结束反应。

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统扫描进行鉴定。

2.4  I型鸭肝炎组织灭活苗的制备

2.4.1  病料处理  无菌取病死雏鸭肝脏作为材料，并去除被膜、结缔组织及胆囊。将病料称重，加入等量生理盐水，置于组织捣碎机中迅速匀浆3～5min，并用4层灭菌纱布过滤，滤渣反复匀浆，合并滤液。在滤液中加入甲醛，使其终含量为0.4%，充分摇匀，等量分装于三个玻璃瓶中，标记为1、2、3号。用玻塞盖口再用溶蜡密封，置于37℃环境中作用24h，每3h振摇一次，使其充分灭活。1号、2号灭活苗中分别加入蜂胶和黄芪多糖为佐剂，3号不加作对照。

2.4.2  无菌检验  取制备的灭活苗分别接种于LB平板、血平板及厌氧肉汤，37℃培养24～48h，观察到没有细菌生长。

2.4.3  安全试验  选20只3日龄易感健康雏鸭，分为2组分别于背烦交界处皮下注射灭活苗2ml/只，并作空白对照，观察9d，无异常情况。

2.5  高免卵黄抗体的制备

2.5.1  疫苗免疫  取160日龄试验蛋鸡60只，分为三组，隔离饲养一周，无异常情况。第1次免疫灭活苗1ml/只，间隔10d进行第2次免疫2ml/只，再间隔10d进行第3次免疫2ml/只。

2.5.2  卵黄抗体效价的测定  采用鸡胚中和试验法测定卵黄抗体的中和效价，每组分别吸取5×1 ml卵黄，并作倍比稀释，取28～212 5个稀释度的卵黄抗体与等量200ELD50病毒液混合，经37℃中和1h后，接种10日龄SPF鸡胚，0.2ml/枚，各5枚，同时设对照组。8d内观察鸡胚死亡情况，按Reed-Muench法计算卵黄抗体中和效价。

2.6  高免卵黄抗体治疗DVH效果  在山东蒙阴县选择森泉家禽合作社的小型蛋鸡场，正常饲喂1周后无异常情况出现，使用黄芪组织灭活苗进行免疫，免疫三次后收集产蛋，将卵黄用生理盐水稀释10倍，4℃静置过夜。

通过流行病学调查和临床症状对发病鸭群进行初步诊断，然后对死亡雏鸭进行病理解剖，主要观察肝脏的病变，对有典型病变的鸭群立即使用上步中制备的高免卵黄抗体进行治疗，方法是每只雏鸭颈部皮下注射1ml。观察记录卵黄抗体对该病的治愈率。

3  结果

3.1  电镜观察结果  见图1。

3.2  ELD50测定结果  见表2。

根据Reed-Muench法计算得ELD50为（0.2ml）l06.659稀释的病毒液。

3.3  RT-PCR诊断结果  病死雏鸭的肝脏组织用所设计的I型鸭肝炎和禽流感特异性引物分别进行RT-PCR，经条件优化，成功扩增出目的片段，与预期片段大小相符，鉴定为I型鸭肝炎和禽流感混合感染。扩增产物经1%琼脂搪凝胶电泳结果见图2。

3.4  卵黄抗体效价测定结果  见表3。

据Reed-Muench法计算得蜂胶组卵黄抗体效价为29，黄芪组卵黄抗体效价为210.8，对照组卵黄抗体效价为27.82。黄芪组效价明显高于其它二者。

3.4  高免卵黄抗体治疗DVH效果  蒙阴县森泉家禽养殖合作社一肉鸭场，1200羽发病，发病日龄为4日龄，发病后紧急注射高免卵黄抗体后，仅有13只发病雏鸭死亡，治愈率达98.9%。

苗家沟养鸭散户550羽3日龄发病雏鸭，经紧急注射后，治愈率达98.2%。

从临床治疗效果看，高免卵黄抗体对鸭病毒性肝炎的治疗效果显著。

4  讨论

在临床中，雏鸭病毒性肝炎与水禽流感混合感染的病例有很多。病毒性肝炎以肝脏肿大、表面有点状或淤斑样出血及肾脏肿大出血为特征;如发病鸭在出现鸭肝炎病症同时伴有一定的神经症状和病死鸭的心肌及胰腺坏死或出血点的特征性病变，即有可能伴有水禽流感的感染。治疗时可用鸭肝炎卵黄抗体和禽流感卵黄抗体进行紧急接种，同时使用金刚烷类、恩诺沙星类抗生素控制后期病毒、细菌的混合感染。黄芪多糖是中药黄芪中主要的天然活性成分，具有促进机体免疫功能、增加白细胞和淋巴细胞数量、提高淋巴细胞转化率和巨噬细胞活性、诱生干扰素等作用。在组织灭活苗制备过程中加入黄芪多糖可更有效地增加免疫效果，从而获得效价较高的卵黄抗体，即可应用于临床鸭肝炎发病紧急治疗。

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