超声强化法提取蓝莓多糖的工艺研究

李敬 赵庆生 周伟杰 赵士豪

摘  要  以蓝莓为材料，利用超声强化法提取蓝莓多糖。在单因素试验基础上，利用响应面法考察超声功率、提取时间、液固比对蓝莓多糖提取率的影响。得到最优提取工艺条件为： 超声功率600 W，超声时间 87 min，液固比49 mg/g，在此条件下，蓝莓多糖提取率理论值为4.93%，验证实测值为4.91%，与预测值接近，说明该试验方案可行。

关键词  蓝莓;多糖;超声强化;响应面分析

中图分类号  S663.9          文献标识码  A

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Polysaccharides from Blueberries by Response Surface Analysis

LI Jing1*， ZHAO Qingsheng2， ZHOU Weijie3，ZHAO Shihao1

1  College of Biology Science and Engineering， Hebei University of Economics and Business， Shijiazhuang， Hebei 050061， China

2  National Key Laboratory of Biochemical Engineering， Institute of Process Engineering，

Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China

3  Huangdao Food and Drug Administration， Qingdao， Shandong 266555， China

Abstract  In the present study， the conditions for ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from blueberries were optimized by response surface analysis. On the basis of single-factor experiments， the relationship between main extraction conditions including ultrasonic power， water to solid ratio and extraction time were modeled using a 3-factor， 3-level Box-Behnken experimental design. The established model was analyzed by response surface methodology to obtain the optimum extraction conditions. The optimum conditions of the ultrasonic wave extraction of blueberries polysaccharides were as follows： extraction ultrasonic power of 600 W， water to solid ratio 49 mg/g and extraction time of 87 min. The predictive maximum yield of blueberries polysaccharides was 4.93%. The average validation value was 4.91%. The optimized technology was stable and viable.

Key words Blueberries;Polysaccharides;Nltrasonic extraction;Response surface methodology

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.022

蓝莓（Vaccinium uliginosum），又称越橘果、越橘、蓝浆果，为杜鹃花科越橘属（Vacctnium）落叶或常绿灌木，是多年生的浆果类果树。蓝莓果肉细腻，风味独特，酸甜适口，营养价值远远高于其他水果，堪称“世界浆果之王”。因其具有较高的保健价值而风靡世界，是联合国粮农组织（FAO）推荐的五大健康水果之一。蓝莓含有丰富的营养物质[1]，如蛋白质、脂肪、碳水化合物，VA、VE、超氧化物歧化酶（SOD）等。此外，蓝莓的微量元素含量也很高，鲜果中含钙、磷、镁、锌、铁、锗、铜等[2]。除含有常见的营养成分外，蓝莓果实中还富含熊果苷、花青苷[3-4]、多酚[5]、胡萝卜素、类黄酮、多糖[6]等。Mattila等[7]发现蓝莓果皮每100 g含酚酸为85 mg。Bere[8]发现蓝莓含有人体必须脂肪酸亚麻油酸，含量约0.25 g/100 g，脂肪则占0.75 g/100 g。不仅具有良好的营养保健作用，还具有较强的抗癌作用[9]、保护心脑血管[10]以及辅助治疗糖尿病[11]等功效。

目前， 蓝莓多糖研究国内鲜有报道，本研究采用超声提取法分离蓝莓中的多糖成分，为蓝莓多糖的生产和应用提供一定的理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

试验材料：蓝莓（蓝丰，采收自北京怀柔）。

仪器：电子分析天平FA2004（上海天平仪器厂），KQ-250DB 型超声波仪（昆明市超声仪器有限公司），8002型恒温水浴控制器（余姚明伟仪表厂），CT15RT台式高速冷冻离心机（上海天美生化仪器设备工程有限公司），RE-52型旋转蒸发仪（上海博通经贸有限公司产品），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），FD-1冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司），2802UV/VIS 分光光度计（尤尼科上海仪器有限公司）。

试剂：乙醇、浓硫酸、苯酚、标准葡萄糖、溴化钾等，所用试剂均为国药集团化学试剂有限公司分析纯产品。

1.2  方法

1.2.1  多糖提取工艺流程   精确称取蓝莓粉末→80%乙醇回流→离心→残渣干燥→超声提取→离心→收集上清液→浓缩→加入4倍体积95%乙醇→低温静置24 h→离心→沉淀→冷冻干燥→多糖

1.2.2  多糖含量测定   采用苯酚-硫酸法进行多糖含量的测定，准确称取干燥恒重的葡萄糖40 mg于500 mL容量瓶中，加水定容，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以水补至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，静止10 min，摇匀，室温放置30 min后于490 nm测光密度，以2.0 mL水按同样显色操作为空白，重复3次，求平均值，以横坐标为多糖浓度，纵坐标为光密度值（OD），得标准曲线。

蓝莓多糖含量的测定：准确称取多糖粉末，加水溶解，按照上述步骤测定并计算纯多糖含量，每个样品做3次。蓝莓多糖提取率按照以下公式计算：

多糖提取率/%=■×100

1.2.3  单因素试验   分别以超声功率、提取时间、液固比以及提取次数为单因素进行试验，考察各单因素对浸提液中水溶性多糖得率的影响。重复3次，求平均值。

超声功率对多糖提取率的影响：固定提取时间、液固比，超声功率分别设定为200、400、600、800、1 000 W。

超声时间对蓝莓多糖提取率的影响：固定液固比、超声功率， 超声时间分别设定为20、40、60、80、100、120、140 min。

液固比对蓝莓多糖提取率的影响：固定超声功率、超声时间，液固比分别设定为30、40、50、60、70 mL/g。

提取次数对蓝莓多糖提取率的影响：固定超声功率、超声时间、液固比，提取次数设定为1、2、3、4次。

1.2.4  Box-Behnken的中心组合试验设计   基于单因素的实验结果，利用Design-Expert软件进行响应面试验设计。

1.2.5  热水提取   为了对比超声提取与热水提取的差别，取适量蓝莓，经前处理，在80 ℃条件下，提取2 h，其他步骤同1.2.2，重复3次，求平均值。

1.2.6  多糖的红外分析    取适量经冷冻干燥的蓝莓多糖与溴化钾充分研磨，压片，用红外光谱仪于4 000～400 cm- 1波长范围内扫描。

2  结果与分析

2.1  单因素试验结果

2.1.1  超声功率对蓝莓多糖提取率的影响   由图1可知，随着超声功率的增加，多糖提取率先升高后降低，多糖提取率降低的原因可能是超声功率过高导致多糖降解所致。600 W时，提取率最高。因此，选取600 W作为下一步优化的因素。

2.1.2  超声时间对蓝莓多糖提取率的影响   由图2可知，随提取时间的延长，提取效率先升高后降低。原因可能在于时间过短，多糖提取不充分;待多糖充分提取之后，继续增加提取时间，多糖在超声作用下发生降解，因此多糖的得率不但没有增加，反而降低。

2.1.3  液固比对蓝莓多糖提取率的影响   液固比对多糖提取率具有重要影响，溶剂量大有利于多糖的扩散，促使多糖快速进入溶剂体系。由图3可以看出，液固比对多糖提取率稍有影响，但不明显，液固比在50 ∶ 1时，多糖提取率达到最高值。

2.1.4  提取次数对蓝莓多糖提取率的影响   由图4可知，提取次数对多糖提取率影响不大。因此，从经济方面考虑，蓝莓多糖提取1次即可。

2.2  响应面设计及结果分析

以单因素试验的结果为基础，根据Box-Behnken设计原则，选取超声功率、提取时间、液固比3个对蓝莓多糖提取率影响显著的因素，采用三因素三水平的响应面分析方法对工艺参数进行优化。试验因素与水平设计见表1。

响应面方案的实验结果见表2。对表2 数据采用Design Expert 8.0 软件进行处理和分析，获得蓝莓多糖提取率（Y）对超声功率、提取时间、液固比的二次多元回归方程：

Y=4.77+0.13A+0.20B+0.21C-0.047AB-0.14AC+0.058BC-0.60A2-0.48B2-0.078C2

对二次回归方程进行方差分析见表3，模型p<0.01，此时回归方差模型极其显著，表明该试验方法可靠。方程失拟项不显著，表明该回归模型与实测值能较好的拟合。回归系数R2=0.955 6>0.9，表明该模型相关度好。回归方程各项的方差分析表明，对多糖提取率影响大小顺序为C>B>A。

各因素之间的相互关系如图5～7所示。由图5可以看出，无论固定提取时间还是超声功率，随着另一变量的增加，多糖提取率都是先升高后降低，说明超声时间和超声功率对多糖提取率影响较为明显。由图6～7可知，固定液固比因素，随着超声功率或提取时间的增加，多糖的提取率先升高后降低，而固定超声功率或提取时间，增加液固比，多糖的提取率都是增加的，说明溶液体系的增大，多糖更容易溶解在液体中，同时受到超声的破坏也不再显著。

2.3  模型验证

根据结果，响应面给出的多糖得率最优方案为： 超声功率598.82 W，超声时间 87.16 min，液固比49.45 mg/mL。为了操作简便，方案修订为超声功率600 W，超声时间 87 min，液固比49 mg/g，在此条件下，蓝莓多糖提取率理论值为4.93%，验证实测值为4.91%，与预测值接近，验证了模型的正确性。

2.4  红外分析

由图8可知，超声提取与热水提取制备的多糖，在红外图谱结构上差异不大;3 334 cm-1的吸收峰为O-H的伸缩振动，1 103cm-1  吸收峰是仲碳-OH 的O-H 变角振动引起;3 334cm-1、1 637cm-1、1 443cm-1、1 103cm-1 吸收峰均出现糖类典型特征的吸收峰，1 744 cm-1附近出现羰基的伸缩振动峰，1 332 cm-1 的吸收峰为C=O对称伸缩振动，表明含有酸性糖成分。

3  讨论与结论

多糖广泛存在于植物根、茎、叶及果实中，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗病毒及辅助降血糖等多种生物活性。因此，植物多糖的提取及特性研究对其开发利用和临床应用具有重要意义。从植物中提取多糖的常见方法有热水提取法、酸碱提取法和酶解提取法。这些方法都有一定的局限性，热水提取法所需能耗较高， 而且在提取过程中， 加热会导致多糖链的断裂;酸碱提取法会将植物中的生物碱或酸性物质一起提取出来，造成所提取的多糖纯度低，还需要进一步的纯化;酶解提取法的不仅成本较高，同时也会将部分多糖降解，造成多糖提取率降低[12]。近年来多种新兴技术应用于多糖提取，例如：超声、微波、超高压辅助溶剂浸提和超临界流体萃取等[13]。其中，超声波属于机械振动波，其空化效应、热效应、机械效应能将植物多糖有效地从细胞内部分离出来，而不破坏多糖的结构，糖活性损失小。同时，超声辅助提取技术还具有提取时间短、提取率高等优点[14]。杨芳等[15]研究板栗多糖的超声提取，在最优条件下，板栗多糖的提取率是传统热水提取法的2.23倍，时间缩短了1.5倍。

超声提取过程是一个复杂的提取和传质过程。超声提取过程中，最主要的影响因素为超声功率，超声时间和液固比[16]。本研究根据Box-Behnken 试验设计原理和响应面分析方法，利用Design Expert 软件进行试验设计和统计分析，以蓝莓多糖提取率为指标，得到了蓝莓多糖提取率与超声功率、提取时间和液固比的回归模型。本研究结果表明，超声功率对多糖提取率影响较为明显，多糖提取率随超声功率的增加先增加后降低。这主要是因为较低的超声功率范围内，提高超声功率有利于破坏植物细胞壁和促进提取溶液的传质，从而提高多糖提取率;当超过某一临界值时，超声波产生的剪切力强度过高，反而引起多糖分子结构的破坏，进而导致多糖提取率下降[16]。魏明等[17]在米糠多糖的超声提取过程中，多糖最佳提取功率为200 W，升高或降低超声功率都会导致多糖提取率下降。不同来源的多糖最佳提取功率不同，Fu等[18]研究超声提取桦褐孔菌多糖，最佳提取功率为100 W。由于超声法是利用超声波的机械剪切作用来提取多糖，超声时间过长可致多糖分子结构的改变，从而降低多糖的提取率及活性，因此超声时间也是影响多糖提取率的一个重要因素[19]。液固比影响着植物颗粒与超声场的接触范围、超声波的辐射半径及溶液黏度，在一定范围内提高液固比有助于提高多糖提取率[16]。但黄秀香等[20]发现当液固比超过一定值时，半枝莲多糖提取率达到最大值后开始下降。本研究最佳提取功率为600 W，最佳的超声时间为87 min，最佳液固比为49 mg/g。在最优条件下，蓝莓多糖提取率理论值为4.93%，验证实测值为4.91%。经验证该模型是合理可靠的，能够较好地预测超声法提取蓝莓多糖的得率。本研究结果为进一步研究蓝莓多糖提供了应用及理论基础。

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