糖网明目颗粒提取物对缺氧/高糖状态下血管内皮细胞肿瘤坏死因子—α、白细胞介素—1α表达的影响

蒿长英等

摘要：目的 观察糖网明目颗粒提取物对缺氧/高糖状态下血管内皮细胞EA.hy926炎症相关因子的影响，并探讨其作用机制。方法 以CoCl2和高浓度葡萄糖干预人脐静脉内皮细胞EA.hy926复制缺氧和高糖模型，MTT法检测细胞增殖能力，半定量RT-PCR检测炎症相关基因表达，ELISA检测炎症相关蛋白表达。结果 缺氧和高糖均能促进EA.hy926细胞增殖，显著上调肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1α（IL-1α）基因和蛋白表达（P<0.05）。药物干预后，细胞增殖能力降低，TNF-α、IL-1α基因和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论 糖网明目颗粒提取物可能通过调控缺氧/高糖状态下内皮细胞TNF-α、IL-1α等炎症相关因子的mRNA和蛋白表达从而达到防治糖尿病视网膜病变的目的。

关键词：糖网明目颗粒提取物；糖尿病视网膜病变；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1α；人脐静脉内皮细胞

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.014

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0050-05

Effects of Tangwang Mingmu Granules on Expressions of TNF-α and IL-1α in Vascular Endothelial Cellsunder Hypoxia/High Glucose HAO Chang-ying1， CHEN Ming-xia2， GUO Ping3， MA Wen-bin1， LV Hai-bo3， DU Pei-pei1， ZHEN Lin-na3， LIU Ye4， LIAN Zeng-lin4 （1.Handian Group， Beijing Red Sun Pharmaceutical Co.， Ltd.， Beijing 100103， China；2.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；3. Handian Group，Beijing Handian Pharmaceutical Co.， Ltd.， Beijing 100103， China；4.Beijing Handian Academy of Chinese Medicine， Beijing 100103， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Tangwang Mingmu Granules on inflammation- associated cytokines in vascular endothelial cells EA.hy926 under hypoxic/high glucose. Methods CoCl2 and high glucose were used to make the hypoxic and high glucose model in human umbilical vein endothelial cell line EA.hy926. EA.hy926 cell proliferation was measured by MTT method. Gene and protein expression levels of inflammatory factors were detected by semi-quantitative RT-PCR and ELISA assay. Results Both hypoxia and high glucose promoted EA.hy926 cell proliferation. The gene and protein expressions of TNF-α and IL-1α were significantly up-regulated under the same condition （P<0.05）. The cell proliferation， TNF-α， IL-1α mRNA and protein expression levels were significantly reduced by treatment of Tangwang Mingmu Granules （P<0.05）. Conclusion The preventive and therapeutic effect of Tangwang Mingmu Granules on diabetic retinopathy might be related to down-regulate the expression of inflammation-associated cytokines of mRNA and protein， such as TNF-α and IL-1α.

Key words：Tangwang Mingmu Granules；diabetic retinopathy；tumor necrosis factor-α；interleukin-1α；human umbilical vein endothelial cell

基金项目：北京市科技计划“十病十药”中药专项（Z121102001112007）

通讯作者：连增林，E-mail：zenglinlian@aliyun.com

糖网明目颗粒是基于中国中医科学院眼科医院高健生教授治疗糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的密蒙花方开发的中药6类新药[1]。临床观察显示，该方对提高DR患者视力、改善视疲劳等临床症状及眼底血管状态疗效显著[2-3]。本课题前期研究结果表明，优化工艺制备的糖网明目颗粒提取物与传统水煎煮工艺比较能明显改善糖尿病大鼠视网膜微血管病理学状态，降低血管生成相关因子的蛋白水平[4]。本实验采用血管内皮细胞模拟DR缺氧/高糖病理环境，进一步探讨缺氧/高糖状态下糖网明目颗粒提取物对人脐静脉内皮细胞EA.hy926炎症相关因子的作用效果，并阐释该药防治DR的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞

人脐静脉内皮细胞EA.hy 926，购于中国科学院上海细胞库。

1.2 药物

糖网明目颗粒处方由女贞子、乌梅、黄连、密蒙花、肉桂、黄芪、益母草组成，饮片购于安国市萌露中药饮片有限公司，女贞子、乌梅、黄连、密蒙花均产于四川，肉桂产于广西，黄芪产于内蒙，益母草产于河北，经北京汉典中医研究院刘晔老师鉴定符合2010年版《中华人民共和国药典》规定。糖网明目颗粒提取物由北京汉典中医研究院提供，采取醇提、水提相结合的方法，将各药材中主要药效物质充分提取，最后经喷雾干燥制成提取物。

1.3 试剂

胎牛血清（FBS），Hyclone，SH30070.03；高糖DMEM培养液，Hyclone，SH30022.01B；0.25%胰蛋白酶， Hyclone，SH30042.01B；DMSO，Amresco，0231；青链霉素混合液，Solarbio，P1400-100；D-葡萄糖，天津市福晨化学试剂厂；MTT，Amresco，0793-1g；PCR试剂盒， TaKaRa，RR019A；ELISA试剂盒，北京鑫方程生物技术有限公司；CoCl2·6H2O，Sigma，C8661-25G；25 cm2细胞培养瓶、96孔细胞培养板、移液管。

1.4 仪器

YT-CJ-2ND型超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司），MCO-175CO2培养箱（SANYO），BDS200倒置相差显微镜（奥特光学），MULTLSKAN MK3酶标仪（Thermo），DPL-ⅡA型喷雾制粒仪（重庆精工制药机械有限责任公司），LXJ-ⅡA型离心机（上海安亭科学仪器厂），BIOMATE型紫外可见分光光度计（Thermo）， JY600电泳仪（北京君意东方电子设备有限公司）， ChampGel5000型全自动凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司），GE4852型PCR仪（杭州柏恒科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 MTT法检测缺氧/高糖细胞增殖能力

EA.hy926细胞第3代经胰酶消化，用普通培养液（含10%FBS、1×105 U/L青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的高糖DMEM培养液）稀释成2.5×104/mL细胞悬液，每孔200 μL接种于96孔培养板，细胞培养过夜后进行分组。空白组换用普通培养液，缺氧组换用CoCl2培养液，缺氧糖网明目颗粒干预组（缺氧+TWK组）换用CoCl2+糖网明目颗粒培养液，高糖组换用高糖培养液，高糖糖网明目颗粒干预组（高糖+TWK组）换用高糖+糖网明目颗粒培养液。每组设5个复孔，每孔加上述培养液200 μL，培养24 h。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内孵育4 h后，弃培养液，每孔加入100 μL DMSO，室温振荡15 min，混匀。待沉淀完全溶解后，用滤光片为492 nm酶标仪测定光密度（OD值）。计算抑制率。抑制率（%）=[OD值空白孔-OD值测量孔）÷（OD值空白孔-OD值调零孔）]×100%。

糖网明目颗粒培养液制备：精密称定糖网明目颗粒提取物0.470 1 g，置50 mL离心管中，于超净台内加40 mL无血清高糖DMEM培养液，涡旋震荡使药物溶解，静置30 min后混匀，以5000 r/min离心20 min，吸取上清液，用0.45 μm滤器无菌条件下过滤后，加入4.44 mL FBS，混匀，制成贮存液，封口，4 ℃冰箱内保存备用。此时贮存液含浓度为10 mg/mL，含10%FBS。临用时将贮存液梯度稀释至所需浓度2.5 mg/mL。

CoCl2培养液制备：精密称定CoCl2·6H2O 0.023 7 g，加10 mL超纯水，溶解，过滤，4 ℃保存，即得10 mmol/L CoCl2母液。临用时用相应液体稀释至50 μmol/L，混匀，进行细胞干预。

D-葡萄糖培养液制备：精密称定0.459 0 g D-葡萄糖，放入36 mL高糖DMEM培养液中，混匀，溶解，过滤，加4 mL FBS，混匀，4 ℃密闭保存。此时，含葡萄糖100 mmol/L，含10%体积分数的FBS。临用时用相应液体稀释至40 mmol/L，混匀，进行细胞干预。

2.2 RT-PCR检测缺氧/高糖细胞相关基因表达

总RNA的提取及质量检测：将3×106个细胞接种于25 cm2培养瓶中，普通培养液培养过夜后，根据分组换用不同培养液继续培养，24 h后弃培养液，4 ℃预冷的PBS洗3遍，加入1 mL RNAiso Plus，刮取细胞，吸至冰盒预冷的1.5 mL EP中，加入1/5体积的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15 s，直至溶液充分乳化。室温静置5 min，4 ℃、13 500 r/min离心15 min。取出离心管，将上层透明水层吸至另一新的离心管中。加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀。室温静置10 min，4 ℃、13 500 r/min离心10 min。小心倒去上清，向含有沉淀的离心管中缓慢加入-20 ℃预冷的75%乙醇1 mL，小心清洗沉淀。4 ℃、13 500 r/min离心5 min。除去上清，室温干燥2 min，加入20 μL 1‰DEPC水溶解沉淀。紫外分光光度法测定总RNA浓度，用1‰DEPC水调整总RNA至相同浓度500 ng/μL。

cDNA反转录反应：冰上配制10 μL RT反应体系[2 μL MgCl2，1 μL RT Buffer，1 μL dNTP Mixture， 0.25 μL RNase Inhibitor，0.5 μL OligodT- Adaptor Primer，1 μL总RNA 样本，3.75 μL RNase Free dH2O， 0.5 μL AMV Reverse Transcriptase]；反应条件：30 ℃、10 min，50 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min；半定量PCR反应引物，北京赛百盛合成。结果见表1。

琼脂糖凝胶电泳及图像分析：1.5%琼脂糖凝胶电泳，用Lane ID凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析测定，基因表达水平以β-actin为参比。

2.3 ELISA检测缺氧/高糖细胞相关蛋白表达

细胞分组及药物干预同“2.1”项。药物干预24 h后，吸取细胞上清液至预冷的1.5 mL无菌EP管中，同组混匀，封口，-80 ℃保存备用。BCA试剂盒测定总蛋白浓度，用PBS调整总蛋白至相同浓度。标准品按照说明书稀释5个梯度，各梯度每孔加样均为50 μL。分别设空白孔、待测样品孔，每组3个复孔。向待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL，混匀。封板膜封板后于37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃液体，甩干，每孔加满洗涤液，重复洗5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL。封板膜封板后37 ℃温育30 min，如前法重复洗5次，拍干。每孔先加入50 μL显色剂A，再加入50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。450 nm波长处依序测各孔光密度（OD值）。以标准物浓度为横坐标，OD值为纵坐标，计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品OD值代入方程，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 糖网明目颗粒提取物对缺氧/高糖状态下血管内皮细胞增殖能力的影响

与空白组比较，用CoCl2干预EA.hy926细胞造成缺氧状态24 h后，该组细胞增殖能力显著提高（P<0.05），提示缺氧状态可以导致内皮细胞增殖；当加入糖网明目颗粒提取物干预后，细胞增殖能力被显著抑制（P<0.05），提示糖网明目颗粒提取物能够抑制缺氧状态导致的内皮细胞增殖。同样，用40 mmol/L葡萄糖干预EA.hy926细胞24 h后，与空白组比较，该组细胞增殖能力显著提高（P<0.05），提示高糖状态可以促进血管内皮细胞的增殖；以糖网明目颗粒提取物干预高糖状态细胞24 h后，细胞增殖能力被显著抑制（P<0.05）。见图1。

4.2 糖网明目颗粒提取物对缺氧/高糖诱导的肿瘤坏死因子-α基因和蛋白表达的影响

血管内皮细胞缺氧24 h后，TNF-α基因及蛋白表达水平均显著上调（P<0.05）；经糖网明目颗粒提取物干预24 h后，TNF-α基因及蛋白表达水平显著降低（P<0.05），见图2。同样，40 mmol/L葡萄糖干预细胞24 h后，TNF-α基因及蛋白表达水平均显著上调（P<0.05）；经糖网明目颗粒提取物干预24 h后，TNF-α基因及蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），见图3。

4.3 糖网明目颗粒提取物对缺氧/高糖诱导的白细胞介素-1α基因和蛋白表达的影响

血管内皮细胞缺氧24 h后，IL-1α基因及蛋白表达水平均显著上调（P<0.05）；经糖网明目颗粒提取物干预24 h后，该基因及蛋白水平均显著降低（P<0.05），见图4。同样，高糖干预细胞24 h后，IL-1α基因及蛋白表达水平显著上调（P<0.05）；经糖网明目颗粒提取物干预24 h后，该基因及蛋白水平均显著降低（P<0.05），见图5。

5 讨论

糖尿病是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，常导致血液流变性及微循环障碍和代谢紊乱，引起组织水肿、缺血和缺氧，导致血管和神经病变[5]。DR是糖尿病常见的严重并发症，也是主要的致盲疾病之一，其发病机制尚不清楚。研究发现，DR中有很多炎症因素参与，因而提出DR是一种炎症疾病[6]。本实验采用人脐静脉内皮细胞EA.hy926模拟DR病变过程中的缺氧/高糖状态，藉以研究糖网明目颗粒对该病发病过程中炎症因子的影响。

TNF-α在血管内皮细胞表面广泛分布，与视网膜血管通透性、血管细胞增殖及眼内新生血管形成有关。研究发现，链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病模型中，TNF-α等炎症因子水平明显高于正常对照组[7]，2型糖尿病早期视网膜病变患者血清中TNF-α表达维持在高水平[8]。

IL-1可能是视网膜炎症引起血视网膜屏障损害的重要因子，其可引起多核细胞和单核细胞向视网膜血管外迁移，血清蛋白向玻璃体内弥散及红细胞向玻璃体内渗漏等，造成视网膜血管内皮细胞间出现许多大裂隙，使血-视网膜屏障出现缺损，导致局部水肿、渗出、出血和细胞浸润，其对TNF-α促进新生血管形成的效应也具有协同作用。研究发现，KK/Upj-Ay小鼠血液和视网膜中TNF-α、IL-1β等炎症因子基因和蛋白表达水平均高于正常对照组[9]。采用链脲佐菌素建立的SD大鼠糖尿病模型发现，早期DM大鼠视网膜中IL-6、IL-1α、TNF-α等mRNA转录水平均显著高于正常组[10]。

本实验结果显示，糖网明目颗粒提取物不仅能抑制缺氧/高糖状态下血管内皮细胞增殖，而且能显著降低缺氧/高糖诱导的炎症相关因子TNF-α、IL-1α的基因和蛋白表达水平。提示该制剂可能通过抑制糖尿病缺氧/高糖状态下血管内皮细胞增殖相关炎症因子，达到防治DR的作用效果。

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（收稿日期：2014-12-01）

（修回日期：2014-12-22；编辑：华强）