烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因对体外原代培养神经元轴突发育的影响

赵 虹 张惊宇 车守梅 赫丹丹 郭朝晖

(哈尔滨医科大学附属四院神经内科，黑龙江 哈尔滨 150001)

目前如何预防和治疗神经退行性疾病已成为亟待解决的问题。神经元缺失、轴突变性是多种神经退行性疾病的一个重要特征。烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶NMNAT是一类功能尚不完全明确的酶类，该类蛋白质在中枢神经系统和外周神经系统中大量表达。NMNAT1催化NAD的合成〔1，2〕。NAD在所有活细胞的新陈代谢中起关键作用，尤其是在中枢神经系统中作为辅酶参与大量转移反应〔3〕，NMNAT1在NAD合成途径中是主要酶〔4〕，轴突变性被认为是中枢神经系统变性疾病的新的治疗靶点，而且沃勒变性是轴突变性的自我损伤过程，往往发生在轴突损伤或神经元变性时，例如帕金森病(PD)或阿尔茨海默病(AD)〔5～7〕，沃勒变性的轴突由 NMNAT1促使 NAD 的合成得到保护〔8〕，已有研究表明在果蝇中过表达NMNAT1基因却能够显著抑制和延缓轴突的退化〔9〕。

1 材料与方法

1.1 动物和药物 原代培养皮层神经元来源于ICR小鼠(SLAC.CHINA)的胚胎，动物实验保护协议由哈尔滨医科大学附属第四医院动物伦理委员会批准。烟酰胺转磷酸核糖基酶抑制剂FK-866购置于美国Cayman化学制品公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA构建 编码小鼠NMNAT1基因的cDNA从小鼠脑cDNA库中经PCR扩增得到的，所用引物:5'-ATGGACTCATCCAAGAAGACAGA-3'和5-TCACAGAGTGGAGTGGAATGGTTGTGCTTG-3'，并克隆到 PIRES2-EGFP载体(Invitrogen公司)中产生野生型过表达NMNAT1(NMNAT1-OE)序列。

1.2.2 shRNA plasmids的生成 专门针对小鼠NMNAT1 mRNA三个非重叠序列设计后构建到H1启动子RNAi载体上(psuper，Oligoengine，USA)。最有效的 19-核苷酸靶序列是 5'-ACGAGTGGATCACCAATGA-3'(KD-shRNA)。非特异性对照寡核苷酸设立为无关序列作为对照，该序列为:5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'(Scr-shRNA)，含干扰序列的寡核苷酸在DNA合成过程中，末端引入BgLⅡ和XhoⅠ酶切位点。所有序列均被测序证实正确。

1.2.3 原代神经元的培养和转染 原代新皮层神经元来源于刚出生小鼠(PO小鼠)的胚胎，简而言之，分离新皮层组织，在4℃含6%葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中清洗2次，然后0.3%胰蛋白酶中37℃消化10 min，并且在补充了B27添加剂 (Invitrogen)0.5 mmol/L左旋谷氨酸和20 mmol/L HEPES的无血清培养基中轻轻磨碎分离，pH7.4在体外培养3～6 d后，神经元用于形态学实验研究。培养的神经元通过电穿孔的方法转染。简单地说，一个包含质粒，电穿孔缓冲物和神经元的混合物移到一个容器中，用转染试剂盒通过电穿孔技术转染。

1.2.4 免疫印记分析 神经元溶解在细胞溶解缓冲液中，(10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、140 mmol/L NaCl、0.2%聚乙二醇辛基苯基醚)，包含蛋白酶抑制剂的混合物中1 h，离心10 min，以合适的SDS-PAGE胶进行蛋白电泳，转移到PVDF(Millipore)膜上，用封闭液稀释一抗，将已封闭的膜置于一抗溶液中4℃过夜，然后放入用辣根过氧化物酶标记的二抗中孵化(1∶5 000;Jackson Immuno Research)，细胞膜用荧光检测试剂(GE，USA)检测，小鼠的单克隆抗体和小鼠的抗β-actin抗体分别来自于Santa cruz(sc-30842)和Chemicon(MAB1501)。

1.2.5 免疫细胞化学 细胞固定于含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS缓冲液中，用5%BSA和0.2%Triton-100在PBS缓冲液中封闭和透化后，细胞在一抗中4℃孵化一夜，然后细胞用Alexa488和Alexa568共轭二抗在室温下清洗孵化1 h。小鼠单克隆抗-Taul(MAB2239)和小鼠单克隆抗体Map2(AB5622)购置于Chemicon。

1.2.6 成像和图像分析 胶片在荧光显微镜下扫描(尼康，日本)，分析神经突的延长和分支，关键是能够成像一个单一神经元的全部过程，并能区别它们是轴突还是树突，对成像轴突，需要使用相对低功率放大(20×)获得图像，包括神经元的成像。被转染的细胞用绿色荧光GFP和轴突特异性标记Tau-免疫双标神经元轴突。Neurolucida软件用来分析轴突的生长，并且计算轴突的长度。

1.3 统计学方法 使用prism5.0软件进行单因素方差分析以及 post-hoct-test。

图1 在原代培养神经元中NMNAT1基因的RNA干扰与过表达

图2 在培养神经元中NMNAT1对轴突形态的影响

2 结果

2.1 小鼠NMNAT1 shRNA和过表达载体在培养的神经元中有效构建 为了研究NMNAT1在中枢神经系统发育中的功能，设计了一个短发卡RNA(shRNA)的针对小鼠NMNAT1 mRNA的shRNA结构(NMNAT1KD-shRNA)，设计了无针对性对照的shRNA(NMNAT1Scr-shRNA)，把每个shRNA结构转染原代培养的神经元，检验敲除内源性NMNAT1蛋白的能力，Western印迹分析显示NMNAT1-OE高表达NMNAT1(6.31±0.24)而KD-shRNA有效敲除了 NMNAT1基因(0.21±0.13，图1)，而 ScrshRNA没有影响到NMNAT1表达(1.71±0.21)。这些结果证明小鼠NMNAT1过表达和干扰慢病毒载体构建在原代培养小鼠神经元中是有效的。

2.2 NMNAT1对培养鼠神经元轴突形态的调节 如图2所示，用NMNAT1-OE或KD-shRNA病毒载体转染了DIV0神经元，并用GFP和轴突特异标志Tau1免疫双标DIV0神经元。过表达和敲除NMNAT1在轴突的总长度和分支上显示出显著的作用(图2)，上调NMNAT1促进轴突的生长和分支，而下调NMNAT1则有相反的作用，没有影响神经元的极性。添加2 nmol/L FK-866在体外也阻滞了轴突的生长，这和下调NMNAT1的数据一致，结果显示在培养的皮层神经元中操纵NMNAT1的表达对轴突的生长有重要作用。见表1。

表1 在培养神经元中NMNAT1对轴突形态的影响(x±s)

3 讨论

本研究发现与转染了Scr-shRNA的神经元比较，敲除了NMNAT1的shRNA引起了轴突分支的显著减少以及总长度的减少。而且过表达NMNAT1促进了轴突的生长，这与过去报道的培养的脊髓背根神经节的神经元相一致〔7〕。轴突在神经元联络时发挥了至关重要的作用，改变轴突结构可能会影响信息的传播过程，如学习和记忆〔10，11〕。本研究结果表明 NMNAT1这个神经退行性疾病的相关蛋白在大脑中高水平表达，在体外培养的大脑皮层神经元中参与促进轴突生长和复杂度的形态变化，提示NMNAT1在神经元形态发生和神经退行性疾病中的一个重要作用。

一项在果蝇的研究表明NMNAT1是作为一个伴护蛋白而起作用〔11，12〕，关于华勒氏变性的几项研究显示 NMNAT1的NAD 合成活动需要它对轴突的保护作用〔11，13～16〕，然而对于中枢神经元，尤其是神经元经历变性的过程时NMNAT1是否作为一个保护蛋白或酶而发挥功能知道的很少。因此，在不同的变性过程中，NMNAT1的不同功能特征将帮助理解它在神经退行性疾病中的作用。本研究结论是第1次展示了NMNAT1在中枢神经系统轴突中所起的作用，已经为研究人员开发了一实验性的实验，在原代培养神经元中通过检测轴突形态去研究不同刺激下NMNAT1的保护作用。

综上所述，本实验阐明了NMNAT1基因的表达水平与神经退行性疾病造成神经元缺失的潜在关系，将为进一步寻找可能的神经退行性疾病的潜在药物靶点奠定基础。

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