山茱萸多糖对AD大鼠c-fos和早老素1表达的影响

范慧晗 刘泰佐 毛金军 欧 芹 (佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

β-淀粉样肽(Aβ)启动了阿尔茨海默病(AD)的发病过程，并在其发生、发展中起关键作用，脑内胆碱能系统的退行性变化与认知功能缺陷程度呈现一致性变化〔1，2〕。而新近的研究发现，细胞分化调控、基因表达调控、细胞骨架构成、细胞周期和细胞存活等一系列细胞事件与AD、糖尿病和肿瘤等发生均有关〔3〕。体外研究中有关Aβ的神经毒性已成为不争的事实，但关于其在体内的毒性作用研究不多，且得到了不一致的结果。而对AD治疗，目前尚无特效方法，临床上主要为对症治疗。笔者的研究已表明，山茱萸及其多糖具有抗衰老作用，可通过提高衰老动物自由基清除能力、降低脑组织P66shc表达水平，上调FoxO蛋白表达、抑制蛋白质非酶糖化反应实现，并能改善D-半乳糖(D-gal)诱导的学习记忆能力减退〔4，5〕。但关于 D-gal和Aβ1～40联合应用对AD模型大鼠海马区c-fos、早老素(PS)1表达的影响以及山茱萸对其作用目前尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 纯种Wistar大鼠75只由大连医科大学动物实验中心提供，清洁级，体重(225±25)g，雌性40只，雄性35只。随机分为6组:青年组(YCG)12只、假手术组(SOG)10只、Aβ对照组(ADG)14只、阳性对照组14只(DON)，水煎剂组(WEG)12只，上述各组均雌雄各半;多糖组(POG)13只，雌性7只，雄性6只。除青年组大鼠外，其他各组按照60 mg/kg体重连续腹腔注射D-gal 42 d后，检测水迷宫后行Aβ海马注射手术。ADG、DON、WEG和 POG大鼠注射 2μl凝聚态Aβ1～40(10 μg/μl)，SOG 大鼠注射 2 μl生理盐水。7 d后再行Morris水迷宫检测，除ADG大鼠外，DON、POG和WEG大鼠连续经胃灌服给药30 d，之后再行水迷宫检测。然后断头处死大鼠并分离海马，一部分用DEPC水处理后-70℃备用;另一部分用10%多聚甲醛灌注行石蜡包埋，切成厚5μm切片备用。

1.2 实验药品 山茱萸购自佳木斯医药采购供应站，产地浙江省;山茱萸多糖购自宁波德康生物制品有限公司(批号20120110)。盐酸多奈哌齐购自济南德信佳生物科技有限公司(批号12072701)。取干燥山茱萸果实，粉碎后蒸馏水浸泡24 h，加热煎煮提取、抽提2次，多糖及水煎剂分别于用前采用双蒸水配置成0.057 g生药/ml的溶液。Aβ1～40购自上海瑞奇生物科技有限公司(批号RA130310)，用前制成10μg/μl凝聚态溶液。特异性抗Tau蛋白、抗P-Tau蛋白抗体购自中山医科大学。Trizol总RNA抽提试剂、DNA marker(DL2000)、TaKaRa RT-PCR试剂购自大连宝生物工程有限公司，DEPC购自Sigma公司，引物为上海生工公司合成，其余药品为国产分析纯。

1.3 指标检测 采用Morris水迷宫法评价学习记忆能力，Tau蛋白、P-Tau蛋白表达的检测采用免疫组化法，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析，以P-Tau/总Tau(P-Tau/Tau)光密度值表示Tau蛋白磷酸化水平。采用 RT-PCR检测c-fos和PS1表达，选择Oligo dT-Adaptor Primer引物合成cDNA。Primer premier 5.0软件设计PCR引物，c-fos:正义引物5'GACAGCCTTTCCTACTACCATTCC 3'，反义引物 5'TATTCCTTTCCCTTCGGATTCTC 3'，扩增片段长度370 bp;PS1:正义引物5'TTACCAGGCAGGTGATAGAGCAAG 3'，反 义 引 物 5'AGATGAAACAATAAGCCAGGCATG 3';扩增片段长度338 bp;采用β-actin为内参，正义引物5'ACTGCCGCATCCTCTTCCTC3'，反义引物5'CTCCTGCTTGCTGATCCACATC 3'，扩增片段长度为399 bp。按照94℃5 min，94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 25 s，41 个循环;72℃ 7 min，进行PCR。产物行琼脂糖凝胶电泳并经凝胶成像系统分析，以同一样品的目的基因与内参照基因β-actin扩增产物的吸光度之比值表示mRNA表达水平。采用比色分析法测定AChE活性，以每mg组织蛋白在37℃保温6 min，水解反应体系中1μmol基质为1个活力单位。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件，实验数据以±s表示，所有数据均经正态性和方差齐性检验，采用F检验，单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验，方差不齐者采用秩和检验;用药前后学习记忆比较采用配对t检验。

2 结果

2.1 AD模型大鼠学习记忆能力的变化及山茱萸多糖的作用

2.1.1 造模前后及给药后逃避潜伏期的测定结果 与YCG组比较，大鼠手术前和造模后的逃避潜伏期均明显延长(P＜0.01)，造模后大鼠的潜伏期也明显长于手术前(P＜0.01)，且手术前各组大鼠逃避潜伏期与SOG组之间无明显差异(P＞0.05);ADG、DON、POG和WEG大鼠在造模后逃避潜伏期无明显差异(P＞0.05);而与造模后比较，DON、POG和WEG大鼠在给药30 d后明显缩短(均P＜0.01)，且与ADG比较明显缩短(P＜0.01或P＜0.05)，3个用药组之间差异无统计学意义，且各组均未达到手术前及YCG大鼠水平。见表1。

2.1.2 大鼠空间探索能力的检测 以单位时间内(60 s)跨越平台次数表示，SOG、ADG、DON、POG和WEG大鼠跨越平台次数在手术前无显著差别，但较YCG明显减少(均P＜0.05);与YCG大鼠比较，造模后各组大鼠跨越平台次数均明显减少(均P＜0.01)，但各组间无显著差别(P＞0.05)，且均显著少于手术前(均P＜0.01)，并且与SOG大鼠比较均显著降低(P＜0.01);与ADG比较，DON、POG和WEG大鼠跨越次数均显著增加(P＜0.01，P＜0.05)，但3组之间比较未见明显差异(P＞0.05)，亦均未达到青年组和手术前水平。见表2。

2.2 AD模型大鼠海马乙酰胆碱酯酶(AchE)活性、Tau蛋白表达的变化及山茱萸的作用 SOG、ADG、DON、POG和WEG大鼠AchE活性较YCG明显增加(P＜0.05或P＜0.01);与SOG比较，ADG、DON、POG和WEG大鼠AchE活性均明显增高(P＜0.01或P＜0.05);与ADG比较，多奈哌齐、山茱萸多糖及水煎剂可明显降低AchE活性(均P＜0.01)，其中POG显著高于DON大鼠(P＜0.05)，但POG与WEG之间无显著差别(P＞0.05)。由图1可见，各组之间Tau蛋白表达无明显差别(P＞0.05)。由表3、图2可见，ADG大鼠P-Tau表达量明显高于YCG和SOG(P＜0.05，P＜0.05);与 ADG比较，DON、POG和WEG大鼠P-Tau蛋白表达显著减少(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)，且明显高于 SOG(P ＜0.05，P ＜0.05，P ＜0.05)。P-Tau/Tau比较结果可见，DON、POG和WEG大鼠P-Tau/Tau水平显著低于ADG(均P＜0.05)，但未达到YCG和SOG大鼠水平。

2.3 AD模型大鼠海马区PS1、c-fos mRNA表达 由表4、图3和图4可见，与YCG组比较，SOG、ADG、DON、POG和 WEG大鼠海马PS1 mRNA表达水平明显增加(均P＜0.01)、c-fos表达明显下降(均P＜0.01);与SOG组比较，ADG大鼠PS1表达显著增高(P＜0.01)，c-fos的表达则显著降低(P＜0.05);山茱萸多糖和水煎剂均可降低AD模型大鼠PS1表达(P＜0.01，P＜0.01)，上调c-fos表达(P ＜0.01，P ＜0.01)，且其作用效果与DOG大鼠无显著差异(P＞0.05)。3个用药组比较，山茱萸多糖对PS1表达的调节作用与水煎剂和阳性药物比较差异显著(P＜0.05)。

表1 AD大鼠逃避潜伏期的变化及山茱萸对其影响(x ± s，s)

表2 AD模型大鼠空间探索能力及山茱萸对其影响(±s，次)

表2 AD模型大鼠空间探索能力及山茱萸对其影响(±s，次)

12 7.103±0.676 - -SOG组 10 5.740±0.4931) 5.374±0.5482) 5.331±0.4932)ADG组 14 6.235±0.6361)3.762±0.4422)3)4)3.843±0.3982)4)DON组 14 6.084±0.7371)3.784±0.4352)3)4)4.554±0.5142)4)8)POG组 13 6.118±0.7961)3.695±0.4682)3)4)4.468±0.5112)4)7)WEG组 12 6.225±0.8461)3.676±0.4822)3)4)4.507±0.5272)4)7)手术前 造模后 给药后YCG组组别 n

表3 各组大鼠海马AchE活性、P-Tau蛋白水平变化(±s)

表3 各组大鼠海马AchE活性、P-Tau蛋白水平变化(±s)

12 0.851±0.087 0.326±0.021 0.454±0.061 SOG组10 1.062±0.1151) 0.329±0.017 0.5424±0.056 ADG组14 1.465±0.1572)4) 0.398±0.0121)12)0.631±0.0842)4)DON组14 1.148±0.1652)12)0.356±0.0131)7)12)0.561±0.0662)7)POG组13 1.205±0.1442)4)8)11)0.366±0.0101)7)12)0.545±0.0581)7)WEG组12 1.185±0.1422)8) 0.372±0.0151)7)0.535±0.0561)7)P-Tau P-Tau/Tau YCG组组别 n AchE(U/mg.pr)

图1 各组大鼠海马区Tau表达(×400)

图2 各组大鼠海马区P-tau表达(×400)

图3 海马区c-fos RT-PCR电泳结果

图4 海马区PS1 RT-PCR电泳结果

表4 各组海马c-fos、PS1 mRNA表达水平(±s)

表4 各组海马c-fos、PS1 mRNA表达水平(±s)

12 0.702 3 ±0.024 2 0.160 2 ±0.019 0 SOG组 10 0.361 2±0.023 72) 0.348 2±0.034 32)ADG组 14 0.313 7±0.035 62)12) 0.706 3±0.071 72)4)DON组 14 0.607 7±0.034 52)4)8) 0.576 3±0.050 32)4)8)POG组 13 0.630 0±0.084 62)4)8)0.501 3±0.078 62)4)8)9)11)WEG组 12 0.613 1 ±0.059 72)4)8) 0.574 7±0.069 02)4)8)-actin YCG组组别 n c-fos/β-actin PS1/β

3 讨论

AD发病原因、机制和过程均十分复杂，研究者根据条件和研究目的等提出了多种模拟AD的动物模型制备方法，本研究说明D-gal和联合Aβ注射均能复制出AD的学习记忆能力的障碍，而联合Aβ注射更接近人类AD患者的渐进性病理学变化〔6，7〕。研究者们常通过测定胆碱乙酰转移酶或AchE活性来衡量Ach的水平，而在AD的发生中学习记忆能力障碍与脑组织 AchE活性改变密切相关〔8，9〕。本研究结果表明，AD模型大鼠海马区Ach的代谢发生异常较单纯的D-gal诱导更为显著，Aβ可能是通过加快Ach代谢的速度而使大鼠学习记忆能力发生进一步减退，其作用机制可能与Aβ的神经毒性、c-fos低表达和PS1表达的增加有关。

本研究显示，多奈哌齐、山茱萸多糖和山茱萸水煎剂明显降低海马区AchE活性，从而可减缓Ach的降解速度。当AD发生时，由于AchE活性的提高加速了Ach的降解，致使海马中Ach水平的不足。有的学者认为Ach的不足与Meynert底核神经元的丢失有关〔10〕。本实验结果还表明，山茱萸多糖的作用与多奈哌齐有差异，但水煎剂和多糖之间对AchE活性的影响无显著差别，说明山茱萸对AchE活性的调节与多糖提取部位有关，但没有多奈哌齐和水煎剂显著，这可能与水煎剂的药物成分较多糖更为复杂，山茱萸的其他有效部位也可调节AchE活性有关。

c-fos可受内皮素等诱导在多种细胞中表达，其表达水平与磷酸化可能直接影响细胞增殖、细胞周期调控、细胞分化以及轴突的生长等，乃至引起细胞的死亡。在正常细胞中呈现比较恒定的低表达。本研究发现，山茱萸多糖及水煎剂可上调c-fos的mRNA表达水平，这种表达上调可能通过影响多种ERK或PKC的活化。研究发现，当c-fos表达增加时，常伴有c-jun的表达，而c-jun与c-fos之间的亲和力要较其与ATF2的更强，通过c-fos与c-jun异二聚体形成干扰了c-jun与ATF2的结合，而后者介导的细胞凋亡信号也会随之减弱，从而发挥c-fos对神经元的保护作用。对PS1表达的结果表明，D-gal及其与Aβ联合使用均可引起海马组织PS1mRNA表达的显著高于YCG，多奈哌齐、山茱萸多糖及水煎剂可降低AD模型大鼠PS1的表达水平。目前，PS1对脑功能的损害作用已成不争之事实〔11〕，其在AD的发生中有重要的作用。PS1可能是作为γ-分泌酶的催化组分而影响其活性，进而影响Aβ的产生和聚集〔12〕。当PS1过表达时，可使Aβ升高并且聚集产生神经毒性。目前的研究除了发现PS的突变促进APP的转运和代谢过程外，还发现PS1对APP的作用与notch信号及细胞凋亡有关。也有研究发现，PS能通过与Tau蛋白结合，进而促进GSK3β对Tau蛋白的磷酸化，加快神经纤维缠结，并对胆碱能表达产生损害。因此笔者推测，山茱萸多糖及水煎剂可能通过降低模型大鼠PS1的表达水平，从而降低Tau磷酸化可能与PS1参与的APP水解释放和胆碱能损伤有关。

综上所述，山茱萸多糖及水煎剂与多奈哌齐均可提高AD模型大鼠的学习记忆能力，其机制与其上调c-fos的mRNA表达水平、降低P-Tau水平、降低PS1表达和乙酰胆碱酯酶活性有关。山茱萸多糖和水煎剂的作用无显著差别，说明多糖是山茱萸提高AD模型大鼠学习记忆能力的重要成分。

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