地锦草对移植性肝癌H22小鼠抑瘤率和免疫功能的影响

王晓敏 高增光 邹志坚(江西中医药大学，江西 南昌 330004)

清热解毒中药地锦草具有体内抗肿瘤、体外诱导肿瘤细胞凋亡的作用，但其机制尚不清楚〔1，2〕。本实验以小鼠H22移植性实体瘤为模型，观察地锦草水提液对移植性肝癌H22小鼠的抑制作用及免疫功能影响，探讨地锦草的体内抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 H22腹水瘤小鼠(中科院细胞库提供);昆明种近交系雄性小鼠，SPF级，体重(28±2)g，江西中医药大学实验动物中心提供，许可证号SXCK(赣)2011-0001。

1.2 药物与仪器 地锦草:购自毫州市永刚饮片厂有限公司，经江西中医药大学中药组鉴定为Euphorbiae humifusae herba，环磷酰胺注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号12060125)。小鼠酶联免疫(ELISA)白介素(IL)-2测试盒(上海西唐生物科技有限公司批号20120712)。电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多，0.001g)。UV-2102紫外分光光度计(尤尼柯仪器有限公司);切片机和脱水机(徕卡)，徕卡DL2500显微镜(德国徕卡);徕卡CCD图像采集系统(德国徕卡)。

1.3 造模、分组及给药 将接种H22瘤种7 d的腹水瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下抽取腹水瘤细胞悬液5 ml经离心稀释，用生理盐水重新悬浮细胞，细胞悬液浓度为1×106/ml。以每只0.2 ml接种于60只昆明种小鼠右腋下，制成实体瘤动物模型〔3〕。接种24 h后，分别随机分成5组，每组12只。低、中、高剂量组、阳性对照组和模型组。分别灌胃不同剂量的地锦草低、中、高剂量组按照(66、132、265 mg·kg-1·d-1)剂量灌胃2 w，阳性对照组按照50 mg·kg-1·d-1尾静脉注射1次，模型组和阳性对照组小鼠灌胃给予生理盐水0.8 ml，连续2 w。

1.4 抑瘤率 给药后14 d称重后处死小鼠，严格剥离干净皮下肿瘤组织和脾脏使用电子秤称重，计算各组脾脏指数和肿瘤抑制率。

1.5 血清IL-2的测定 离心分离血清，按试剂盒说明采用ELISA法进行检测。

1.6 肿瘤细胞形态学的观察 瘤体固定在10%甲醛中做石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察细胞形态。

2 结果

2.1 地锦草对移植性肝癌H22小鼠生长的影响 用药后高剂量地锦草与阳性对照组对移植实体瘤均有明显抑制作用。高剂量地锦草组瘤重量较模型组明显缩小(P＜0.05)，但其抑制作用不如阳性对照组;低剂量和中剂量地锦草组与模型组比较无统计学差异(P＞0.05)。与模型组比较，高剂量与阳性对照组的抑制率明显上升(P＜0.01)，但中剂量和低剂量无统计学差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组移植性肝癌H22瘤重及抑瘤率比较(x ± s，n=10)

2.2 地锦草对移植性肝癌H22小鼠脾指数和血清IL-2的影响 用药后地锦草与阳性对照组小鼠脾指数均有升高，但地锦草组与模型组比较无统计学差异(P＞0.05)，其抑制作用不如阳性对照组。地锦草与阳性对照组小鼠血清IL-2均有升高，高、中、低剂量地锦草组与模型组比较有显著差异(P＜0.05);见表2。

表2 各组移植性肝癌H22小鼠脾指数和血清IL-2比较(x ± s，n=10)

2.3 组织形态学变化 模型组瘤区肿瘤细胞部分呈椭圆或圆形，胞核大深染，病理性核分裂象多见，核质比增大，有明显的异型性，细胞排列成团块状。地锦草组和阳性对照组肿瘤细胞数量明显减少，可见明显的核固缩和核碎裂;部分瘤组织内有不同程度的坏死呈红染区及淋巴细胞浸润，以高剂量组最为显著。见图1。

图1 各组肿瘤的形态(HE，×20)

3 讨论

中医学认为热毒是恶性肿瘤发生、发展的重要原因之一。如《灵枢·百病始生篇》云“积之始生，得寒乃生，厥乃成积矣。”和明·徐春围在《古今医统》中亦指出“气血日亏，相火渐炽，几何不致噎膈。”即热邪久留体内，血遇热则凝，津液遇火灼为痰，热与痰、瘀等蕴结形成热毒，热毒阻塞于经络脏腑形成肿瘤〔4〕。且肿瘤的机械压迫致使脏器血管受压或梗阻，造成脏器功能失调及血循环障碍，容易发生感染。炎症或感染往往是促使肿瘤恶化和发展的因素之一。清热解毒中药能控制和消除肿瘤及其周围的炎症和水肿，临床上常使用清热解毒药物治疗肿瘤，阻止肿瘤发展〔5，6〕。如清热解毒中药白花蛇舌草可使癌细胞有丝分裂象受到显著的抑制，使癌组织变性坏死〔7，8〕。本研究观察给予清热解毒中药地锦草后瘤重明显减轻，抑制率升高，且光学显微镜下肿瘤细胞数明显减少，出现核深染、异形细胞减少，固缩和死亡的肿瘤细胞增多，淋巴细胞浸润增多的形态学变化，提示地锦草能够抑制肿瘤细胞的生长。脾脏的脏器系数是衡量机体免疫功能的初步指标〔9〕，IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子，并参与抗肿瘤效应和移植排斥反应。IL-2促进T细胞激活，增强T细胞杀伤活性，延长T细胞在体内时间，同时还可以诱导T细胞产生IFN-γ、TNF等细胞因子，增强机体杀伤肿瘤细胞能力〔10〕。本实验结果显示地锦草能提高脾指数、增加血清IL-2的水平，推测这是地锦草提高机体的免疫力来抑制肿瘤细胞生长机制之一。现代药理学研究证明地锦草的抗炎、抗真菌及调节免疫作用与黄酮、三萜、香豆素、甾醇、鞣质及酚酸类等化合物的有效成分有关〔11〕。地锦草提高机体免疫力来抑制癌细胞生长的具体成分有待深入研究。

1 玮 罕，耿果霞，李青旺，等.地锦草抗宫颈癌活性研究〔J〕.中国畜牧兽医，2010;37(3):192-4.

2 孔 薇.周仲瑛辨治泌尿系统肿瘤的思路及方法〔J〕.江苏中医药，2011;4(6):10-1.

3 刘海军，孙晋民，贾兰玲.杜香提取物抑制荷瘤H22小鼠生长的实验研究〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(19):3743-4.

4 李 超，樊巧玲.从“毒邪”论治恶性肿瘤〔J〕.山西中医学院学报，2012;13(3):134-5.

5 刘磊磊，陈娟，师彦平.清热解毒中药抗肿瘤作用研究进展〔J〕.中草药，2012;43(6):1203-12.

6 王洪琦，崔娜娟，胡 玲，等.清热解毒中药对荷瘤鼠恶性肿瘤HSP70免疫作用影响的实验研究〔J〕.新中医，2006;38(2):91-3.

7 胡 玲，王洪琦，成晓燕，等.白花蛇舌草对H22肝癌细胞热休克蛋白70表达的影响〔J〕.广州中医药大学学报，2007;24(1):44-6.

8 于春艳，李 薇，刘玉和，等.白花蛇舌草提取物体外抗肿瘤作用及机制研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2004;5(5):412-6.

9 汤小军，黄建春，黄仁彬，等.六月青多糖对S180荷瘤小鼠免疫功能及 p53，Bcl-2，Bax表达的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2013;19(4):250-4.

10 Weiss JM，Back TC，Anthony J，et al.Successful immunotherapy with IL-2/anti-CD40 induces the chemokine-mediated mitigation of an immunosuppressive tumor microenvironment〔J〕.Proc Natl Acad Sci，2009;106(46):19455-60.

11 李治建，古力娜·达吾提，斯拉甫·艾白.维药地锦草的研究进展〔J〕.中国民族医药杂志，2008;8(8):15-21.