蓝莓中总黄酮的提取及抗氧化活性研究

古力齐曼·阿布力孜， 阿吾提·艾买尔， 迪丽努尔·马里克

（新疆师范大学化学化工学院新疆乌鲁木齐830054）

蓝莓中总黄酮的提取及抗氧化活性研究

古力齐曼·阿布力孜， 阿吾提·艾买尔， 迪丽努尔·马里克∗

（新疆师范大学化学化工学院新疆乌鲁木齐830054）

文章优选蓝莓中总黄酮的最佳提取工艺，考察蓝莓中总黄酮提取液的抗氧化活性。通过单因素试验和L9（34）正交试验，确定蓝莓中总黄酮的最佳提取条件，通过清除OH·、DPPH·和O-2·以及还原力实验来评价蓝莓中总黄酮体外抗氧化能力，并与Vc进行了比较。蓝莓中总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度40%、液料比1∶18（V∶m）、微波功率250W、超声功率50W、提取温度55℃、提取时间7min；在此工艺条件下，蓝莓中总黄酮提取率最高，其含量达6.433%。抗氧化活性测定结果表明，蓝莓中总黄酮的抗氧化性明显高于Vc，而且对OH·、DPPH·和O-2·均有较好的清除能力。该方法简单、快速，蓝莓总黄酮是一种有效的自由基清除剂。

蓝莓；总黄酮；超声-微波辅助提取法；抗氧化活性

黄酮类化合物是一大类天然产物，是许多中草药的有效成分［1］。它的存在形式有两种，一种是游离的苷元，另一种是与糖等结合的苷［2］。黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂［3］，能改善血液循环［4］、降低胆固醇。能降低心肌耗氧量，增加冠脉、脑血管血流量，明显缓解心绞痛、抗心律失常等，对防治心肌梗塞、心律失常等也有重要疗效［5］等诸多功效，已列为保健食品的一类功能因子。为此，笔者以蓝莓果实为原料，采用超声-微波辅助提取法研究蓝莓果实中总黄酮的提取工艺，优选蓝莓中总黄酮的提取工艺，并对提取液进行抗氧化活性研究［6-10］，为利用蓝莓工业化生产黄酮类化合物提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料与试剂

蓝莓果实（采自新疆伊宁市）、芦丁准品中（国药品生物制品检定所）、乙醇（95%）、5%的亚硝酸钠溶液、10%的硝酸铝溶液、4%的氢氧化钠溶液、Vc、DPPH自由基、去离子水、硫酸亚铁溶液（AR）、双氧水（AR）、水杨酸（AR）。

1.1.2 仪器设备

UV-7502PCS紫外可见分光光度计（上海京工实业有限公司）；RE-5220旋转蒸发器（上海垒固仪器有限公司）；U-3310紫外可见分光光度计（日本日立公司）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；电热恒温水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备

精密称取干燥至恒重的粉碎过的蓝莓果实粉末1.0g于50mL圆底提取瓶中，在一定料液比、溶剂浓度、温度、功率、提取时间等条件下→浸泡→超声-微波提取→抽滤→浓缩，充分洗净残渣滤干燥后备用。

1.2.2 最大吸收峰的确定

精确吸取芦丁溶液3.2mL，置于10mL的容量瓶中，加入35%的乙醇定容至5.4mL，加入0.3mL5%的亚硝酸钠（NaNO2）溶液，摇匀，放置6min，加入0.3mL10%的Al2（SO4）3溶液混匀，放置6min，再加入4mL4%的氢氧化钠溶液，混匀，静置15min，以空白为对照，立即在400nm-600nm波长范围内进行扫描，确定其最大吸收波长。最大吸收波长为508nm。

图1 最大吸收波长

1.2.3 标准曲线制备及回归方程建立

精确称取芦丁对照品40mg置于100mL的容量瓶中，加入体积分数为35%的乙醇定容，精确移取芦丁对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、2.8、3.2mL，用35%的乙醇定容至5.4mL，加入0.3mL5%的NaNO2溶液，摇匀，放置6分钟，加入0.3mL10%的Al2（SO4）3溶液混匀，放置6分钟，再加入4mL4%的NaOH溶液，混匀，静置15分钟，在最大吸收波长处测量吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制芦丁标准溶液的标准曲线。回归方程为：A=3.6818C＋0.0017，相关系数（r=0.9982）。

1.2.4 样品总黄酮含量的测定

以蓝莓残渣为原料，经有机溶剂浸提总黄酮，提取液减压过滤后定容至100mL，每次准确量取1.0mL。代入回归方程（1）中计算，得出提取液中总黄酮含量。

总黄酮提取率（%）=C×100×100（w-w×b）×1000×100

式中w—样品的重量（单位g）；C—提取液中总黄酮含量（单位mg／mL）；b—样品的含水量（单位%）。

1.2.5 提取条件的优化

为了全面考察超声—微波提取的最佳工艺参数，在单因素实验的基础上，以超声功率、超声温度、料液比和超提取声时间等4种因素进行L9（34）正交试验，确定最优方案，因素水平如表1所示。

表1 因素水平表

1.2.6 抗氧化实验

1.2.6.1 羟自由基清除率的测定

取7支试管各加入9mol／L的FeSO4mL，9mol／L的水杨酸-乙醇溶液1mL，样品1mL（浓度分别是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6）再加入8.8mol／L的H2O21mL，放入37℃水浴中反应0.5h。以去离子水作为参比，空白组用去离子水代替样品。以Vc（抗坏血酸）作为对照物，操作同上，在510nm处测定吸光度，重复做三次，取平均值代入下式计算清除率。

1.2.6.2 DPPH·清除率的测定

吸取不同质量浓度的样品（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg／mL）2 mL，移入试管中，加0.04mmol／mL DPPH ·的乙醇溶液2.0 mL，置暗处30分钟，重复做3次。在517 nm波长处测定吸光度，以空白作参比，按下式计算清除率。

式中，A0代表2 mL DPPH·溶液加入2 mL无水乙醇；

Aj代表2 mL提取液加入2 mL无水乙醇吸光度；

Ai代表2 mL提取液加入2 mL DPPH·溶液的吸光值。

取50 mol／L的Tris-HCl缓冲溶液（pH=8.2）4.5 mL，加入4.2 mL去离子水，混匀后在25℃水浴中保温20 min，取出后立即加入在25℃水浴中预热过的3 mmol／L的邻苯三酚溶液0.3 mL（以10 mmol／L的HCl代替邻苯三酚作为空白），混匀后立即倒入比色皿中，于420nm处每隔30 s测定吸光度1次，共测5 min，计算对照溶液吸光度随时间的变化率A0。然后依照上面方法实验，在加入邻苯三酚前先加入1.0 mL总黄酮提取液，再加入3.2 mL去离子水，其余按上面方法操作，计算总黄酮提取液吸光度随时间的变化率Ai。将A0和Ai代入下式计算总黄酮提取液对·的清除率

式中A0为空白的平均吸光度；Ai为样品的平均吸光值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 乙醇浓度对提取率的影响

1.0 g已烘干粉碎处理过的蓝莓果实粉末加10mL。微波功率为300W，料液比10∶1，超声功率50W，乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%。过滤，提取三次合并滤液在40℃-50℃左右浓缩。在508nm处测定吸光度，结果见图2所示。

图2 乙醇浓度因素对提取率的影响

由图2可知，总黄酮提取率随乙醇浓度增大而增大，当乙醇浓度40%后，提取率开始下降，从成本和得率来考虑，乙醇浓度为35%-45%较为合适。

2.1.2 料液比对提取率的影响

1.0 g已烘干粉碎处理过的蓝莓果实粉末加10 mL其浓度为分别为65%乙醇，提取温度55℃。微波功率为60W，超声功率50W。其料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25过滤，提取三次合并滤液在40℃-50℃左右浓缩。在508nm处测定吸光度，结果见图3所示。

图3 料液比对提取率的影响

由图3可知，总黄酮提取率跟料液比成正比，料液比达到1∶15时，提取率最大；1∶15后，提取率趋于下降，这是因蓝莓果实中总黄酮含量有限，所以选择料液比1∶10-1∶20为宜。

2.1.3 微波功率对提取率的影响

1.0 g已烘干粉碎处理过的蓝莓果实粉末加10mL其浓度为65%的乙醇，提取温度55℃，超声功率50W，微波功率分别为100W、200W、300W、400W、500W过滤，提取三次合并滤液在40℃-50℃左右浓缩。在508nm处测定吸光度，结果见图4所示。

图4 功率因素对提取率的影响

由图4可知，总黄酮提取率随微波功率增大而缓慢升高，在200W时趋近于最大值，故选择提取功率为100W-300W间较为合适。

2.1.4 提取时间对提取率的影响

1.0 g已烘干粉碎处理过的蓝莓果实粉末加10mL其浓度为65%的乙醇，提取温度55℃。微波功率为400W，超声功率50W，提取时间分别为3min、6min、9min、12min、15min。过滤，提取三次合并滤液在40℃-50℃左右浓缩。在508nm处测定吸光度，结果见图5所示。

图5 时间因素对提取率的影响

由图5可知，在3min至6min时提取率随提取时间延长而逐渐升高。当提取时间大于6min时，蓝莓中总黄酮的提取率下降。故提取时间以5min-7min较为合适。

2.2 超声-微波总黄酮提取正交实验

根据单因素实验结果，按照L9（34）正交表进行正交实验，正交因素水平如表2所示，实验结果及数据分析见表2。

表2 正交试验设计及结果

2.3 方差分析

表3 方差分析表

由表2可知，根据极差R分析，超声-微波辅助提取蓝莓中总黄酮的最佳工艺条件为A3B2C1D3即乙醇浓度40%、提取时间6min、微波功率150W、液料比1∶18。各因素对蓝莓中总黄酮提取量的影响顺序为：微波功率（C）＞料液比（D）＞乙醇浓度（A）＞提取时间（B）。从表3方差分析可知微波功率和料液比表现出显著性差异，而乙醇浓度和提取时间未表现出显著性差异。

2.4 抗氧化实验结果

2.4.1 蓝莓中总黄酮提取液对OH·的清除作用

利用Fenton反应，检测蓝莓提取液和Vc对OH·的清除作用，其结果如图6所示。

图6 蓝莓中总黄酮与Vc对OH·的清除作用

由图6可以看出，在所选质量浓度范围内，提取液和Vc对OH·都有一定的清除能力，其效果与添量呈正相关性。随着浓度的增大，对OH·清除能力也增加，呈现出较好的量效关系。总黄酮和Vc对OH·清除率的IC50值分别为0.24 mg／mL和0.45mg／mL，总黄酮对羟自由基的清除率比Vc强约1.8倍。

2.4.2 蓝莓中总黄酮提取液对DPPH·的清除作用

蓝莓中总黄酮提取液对DPPH·的清除作用由图7可看出，总黄酮和Vc都对DPPH·有一定的清除能力，而且，其清除能力随着浓度的增加而增大。总黄酮和Vc对DPPH·清除率的IC50值分别为0.15mg／mL和0.17mg／mL，蓝莓中总黄酮对DPPH·的清除率比Vc稍强。

图7 蓝莓中总黄酮和Vc对DPPH·的清除

2.4.3 蓝莓中总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用

图8 蓝莓中总黄酮和Vc对超氧阴离子自由基的清除

3 结论

正交实验及方差分析结果表明，以蓝莓为原料，采用超声-微波辅助法提取黄酮，研究蓝莓黄酮提取分离工艺。蓝莓中总黄酮最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为40%、液料比为1∶18、超声功率50W、微波功率为250W、提取温度55℃、提取时间7min。在此工艺条件下，蓝莓黄酮提取率达到最大值，即6.644%。用法具有快速、高效、简单、且无污染等特点。

蓝莓提取液的抗氧化活性实验结果表明，蓝莓总黄酮不仅具有较强的还原能力，而且对OH·、DPPH·均有较好的清除能力，且在一定范围质量浓度内对三者的清除作用呈现良好的量效关系。因而可知，蓝莓果实具有较好的抗氧化活性，可以利用蓝莓的这个特点制作各种抗氧化保健药品，对蓝莓的开发利用有重要意义，为科研工作者们制作该类药品提供实验基础。

［1］顾仁勇，朱爱华，等.超声波预处理微波萃取葛根总黄酮的工艺优化［J］.食品科学，2011，32（10）：57-58.

［2］李志洲，刘军海.草莓中黄酮的提取及其抗氧化性研究［J］.天然产物研究与开发，2009，28（07）：32-33.

［3］程红梅，张志勇.微波法提取新疆罗布麻叶总黄酮及抗氧化性研究［J］.中国酿造，2012，214（1）：215-218.

［4］张彦丽，茹鲜古丽·哈斯木，等.超声微波协同萃取法提取昆仑雪菊中总黄酮的研究［J］.广州化学，2011，39（21）：45-51.

［5］甘琳，周芳，等.葛根总黄酮提取工艺的比较［J］.时珍国医国药，2010，21（4）：929-930.

［6］吴琼英，贾俊强.柚皮黄酮的超声辅助提取及其抗氧化性研究［J］.食品科学，2009，30（2）：29-33.

［7］戴玉锦，卢明，等.微波法从柚皮中提取黄酮类化合物的工艺研究［J］.江苏农业科学，2006，1（1）：12-15.

［8］蒋光月，万水霞，等.蓝莓的营养价值与栽培条件［J］.安徽农学通报，2011，（19）：77-82.

［9］乌兰格日乐，白海泉，等.黄酮的抗氧化活性研究进展［J］.内蒙古民族大学学报，2008，3（1）：23-29.

［10］方敏，占才贵，等.玉米须总黄酮的提取及抗氧化性研究［J］.食品科学，2009，19（1）：206-208.

［11］王芳，淡小艳.橘皮黄铜提取的响应面优化及抗氧化活性研究［J］.浙江师范大学学报，2012，35（1）：92-98.

Extraction of Total Flavonoids from Blueberries and Antioxidant Activity

Gulqiman·ABLIZ， Awut·AMAR， Dilnur·MALIK∗
（Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang Normal University，Urumqi，Xinjiang，830054，China）

To optimize the best extraction conditions of total flavonoids from Blueberries and to exam the antiox⁃idant activity of total flavonoids extracts.Methods：Using the orthogonal test of L9（34）to determine the content of total flavonoids and the best optimum extractions and the antioxidant activity was evaluated by the methods of OH·、DPPH··and reducing power and compared with the antioxidant activity of Vc.Results：the extraction conditions of total flavonoids in Blueberries：40%vol ethanol solution、liquid／material radio 18∶1（V∶m）、ultrason⁃ic power was 50W、microwave power was 250W、extraction temperature was 55℃、extraction time was 7 minutes；Under such conditions，the yield of total flavonoids was 6.433%.Antioxidant activity results showed that antioxidant activity of the flavonoids from Blueberries was obviously higher than Vc，and OH·，DPPH·，and·all have good ability to remove.Conclusion：this method was simple、quick，Blueberry flavonoids is a kind of effective free radical scavenger.

Blueberry；Total flavonoids；Ultrasonic-microwave assisted extraction；Antioxidant activity

R284

A

1008⁃9659（2015）03⁃007⁃08

2015-06-05

新疆少数民族科技人才特殊培养计划科研项目资助（201423121）。

古力齐曼·阿布力孜（1988-），女，新疆阿克苏人，硕士研究生，主要从事天然产物的研究。

∗［通讯作者］迪丽努尔·马里克（1964-），女，新疆乌鲁木齐人，教授，主要从事天然产物方面的研究。