碱性鞘磷脂酶基因剔除鼠的基因型和表型特征

杨俐萍，朱顺星，闵娅兰，刘焕良，钱红燕，陈橼，朱菁烨，邵晶晶，雒润华，李静，段瑞冬

（1.南通大学附属肿瘤医院肿瘤研究所中心实验室，江苏南通 226361；2.南通大学实验动物中心，江苏南通 226001；3.瑞典LUND大学胃肠营养实验室，LUND瑞典，S-22184）

研究报告

碱性鞘磷脂酶基因剔除鼠的基因型和表型特征

杨俐萍1*，朱顺星2，闵娅兰1，刘焕良1，钱红燕1，陈橼1，朱菁烨1，邵晶晶1，雒润华1，李静1，段瑞冬3

（1.南通大学附属肿瘤医院肿瘤研究所中心实验室，江苏南通 226361；2.南通大学实验动物中心，江苏南通 226001；3.瑞典LUND大学胃肠营养实验室，LUND瑞典，S-22184）

目的为研究alk-SMase在结肠癌发生发展中的作用提供动物模型的实验数据。方法将野生型（WT，+/+）、杂合子（+/ˉ）、纯合子（KO，ˉ/ˉ）alk-SMase基因剔除小鼠剪尾提取DNA，PCR法作基因型鉴定；取其肝肠组织进行HE染色、激光共聚焦分析以及质谱仪检测，观察和分析不同基因型鼠的表型特征。结果与WT和杂合子比较，KO鼠显示：外观和体重无明显区别；基因型鉴定出现一个条带，其分子量为247 bp；小肠黏膜明显增厚，但alk-SMase表达减弱；质谱分析显示在肠道和肝脏中的鞘磷脂含量增高，1-磷酸鞘氨醇含量增加，而神经酰胺含量降低。结论alk-SMase KO鼠有明显特征，但其外观和体重与其他基因型比较没有明显区别，为研究alk-SMase的生物功能提供了一个理想的动物模型。

碱性鞘磷脂酶；基因剔除小鼠；基因型；表型

碱性鞘磷脂酶（alkaline sphingomyelinase，alk-SMase）是肠道中鞘磷脂代谢的关键酶，其通过水解鞘磷脂（sphingomyelin，SM）产生一系列生物活性物质，如神经酰胺（ceramide，Cer）和1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-P，S1P）来调控细胞的生长、凋亡及炎症反应［1，2］。近年来，随着对alk-SMase的深入研究，特别是alk-SMase基因剔除（konckout，KO）鼠模型的成功建立［3］，人们对此酶在生理病理方面的作用有了更进一步的理解，发现它在结肠癌发生发展的研究中起着重要的工具作用［4］。然而，对经过转基因技术产生的alk-SMase KO鼠本身的特征尚未见有全面的报道。为了阐明alk-SMase KO鼠的背景特征，使该模型能更好地应用于alk-SMase功能及其在肿瘤中作用的研究，我们从瑞典隆德大学实验动物中心（瑞典隆德大学段瑞冬教授惠赠）引进了alk-SMase KO杂合子小鼠，在南通大学SPF实验动物中心饲养繁殖，并对其仔鼠进行基因鉴定和表型分析。

1 材料和方法

1.1 实验动物

5只杂合子、3只纯合子alk-SMase KO鼠，其中有4只雄性和4只雌性，来源于瑞典LUND大学实验动物中心（2012年由段瑞冬教授惠赠），经中国海关安全检查后入驻南通大学SPF动物中心，并饲养繁殖。该小鼠遗传背景为C57BL/6，近交系，由南通大学实验动物中心提供【SCXK（苏）2014ˉ0001】。动物的饲养繁殖以及实验在南通大学实验动物中心进行【SYXK（苏）2012ˉ0031】，并通过南通大学实验动物伦理委员会的审批，批准号为NTU-KO-2012-009。

1.2 饲养和繁殖

按照SPF级动物饲养标准进行饲养，实行自由采食和饮水。采用1对1雌雄鼠“长期同居”方式进行繁殖。母鼠孕期为19～21 d，哺乳期为18～23 d。在幼鼠3周龄时，断奶分笼，打标记并进行基因鉴定。

1.3 基因型鉴定

1.3.1 组织DNA的提取

将小鼠尾部组织小段（长约0.5～1.0 cm）置入1.5 mL Eppendorf管中，参照Fermentas的Fast tissue-to-PCR试剂盒（Thermo，美国）抽提DNA。

1.3.2 PCR反应及琼脂糖凝胶电泳基因型鉴定

引物设计参照相关文献［3］，上游引物：5’-CTGCCACTTTACACTGGTCAC，下游引物：5’-TGGCACTGAGGCGAGAAC。PC仪循环扩增反应条件：95℃10 min预变，95℃30s变性，55℃30s退火，72℃1min延伸，共35个循环。电泳鉴定：分别取10μL PCR扩增产物及DNA ladder（Thermo，美国）加载在含40μL GelRed的1.0%琼脂糖凝胶中，经100V 30 min电泳后置于凝胶成像仪ChemiDocXRS +（Bio-Rad，美国）观察拍照。

1.4 表型观察和分析

1.4.1 外观及体重

定期观察野生型（wild type，WT）、杂合子，KO三种不同基因型小鼠毛色及测量体重的变化。

1.4.2 组织切片HE染色

取25周龄的三种不同基因型的小鼠各5只鼠的小肠、大肠、肝脏，将组织置于4%多聚甲醛固定中固定，按常规病理标本制备方法进行石蜡包埋、切片以及苏木精和伊红（HE）染色，显微镜摄像分析。

1.4.3 激光共聚焦分析

制备小肠新鲜冰冻切片标本：组织标本经4%多聚甲醛固定过夜后，用30%蔗糖脱水6 h以上，OCT包埋。采用冰冻切片机（Leica，德国）按6μm厚度切片。依照免疫荧光染色方法对切片染色：经10%牛血清白蛋白封闭后加入抗alk-SMase抗体（瑞典LUND大学段瑞冬教授赠）4℃过夜，PBS漂洗3次后加入荧光二抗（驴抗兔-FITC绿色荧光）室温40 min，经PBS漂洗3次后封片，激光共聚焦摄像分析。

1.5 质谱仪检测

取7～10只14～16周龄WT及KO鼠，安乐死后快速取其小肠、大肠、肝脏器官组织，用4℃PBS冲洗内容物后，将组织放在液氮中研磨成粉末状，ˉ 80℃中保存。按照参考文献［5］的方法提取磷脂并采用质谱仪（Applied Biosystems，美国）测定其代谢产物的含量（由中科院化学研究所测定）。

2 结果

2.1 基因型鉴定

取3周龄仔鼠尾部组织DNA进行PCR扩增显带，3种基因型的条带显示见图1：m1、m2只出现732 bp条带，为WT（+/+）；m3、m5出现732 bp和247 bp两个条带，为杂合子型（+/ˉ）；m4、m6、m7只出现247 bp条带，为KO型（ˉ/ˉ）。

注：m1～m7为小鼠尾部组织DNA样本，M：DL3000分子量标记，DNA分子分别显示在732 bp和247 bp条带上。+/+为WT，+/ˉ为杂合子型，ˉ/ˉ为KO。图1 alk-SMase WT、杂合子和KO的基因型PCR鉴定Note.m1ˉm7 represent the tail DNA samples derived from the offspringmice of alk-SMase KO.M，DL3000DNA ladder. On the gel there are two bands，732 bp and 247 bp，+/+ wild type，+/ˉheterozygous，ˉ/ˉhomozygous.Fig.1 alk-SMase genotyping by PCR

2.2 小鼠的生长、外观及体重变化

母鼠孕期19～21 d，每胎产仔6～10只，仔鼠成活率＞95%，成熟期；雄性10周，雌性8周。KO和杂合子型与同窝WT小鼠比较，毛色正常，外观和体重上未见明显差异（见图2）。

2.3 组织形态学特征

显微镜下观察不同基因型鼠的肠壁及肝组织的HE染色切片，发现：WT和杂合子的肠黏膜、肝组织均无明显区别，而KO小肠黏膜有明显增厚，几乎为WT的3倍（图3右上），但其结直肠黏膜及肝组织的形态则无明显差别（见图3）。

2.4 alk-SM ase蛋白的荧光表达

将带有绿色荧光标记的抗alk-SMase抗体对不同基因型鼠的肠黏膜进行免疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜观察到：WT肠黏膜上的alk-SMase表达是显而易见的，而杂合子和KO肠黏膜上的alk-SMase表达量均下降，在KO肠黏膜上的表达几乎消失（见图4）。

注：A.正面像，左侧鼠为WT（+/+），右侧鼠为KO（ˉ/ˉ）；B.背面像，左侧鼠为WT（+/+），右侧鼠为KO（ˉ/ˉ）。与WT比较，KO小鼠毛色正常，体重无明显差异。图2 alk-SMase KO与WT鼠外观形态的比较Note.A，B：Photos taken from frontand back of themice，wild-type（+/+）on the left，homozygous（ˉ/ˉ）on the right in each photo.Among the same age littermates there are no differences in the appearance and body weight regardless of genotype.Fig.2 Gross appearance of the alk-SMase KOmice

2.5 鞘脂代谢产物的质谱分析

SM在alk-SMase的酶解作用下生成Cer，继而产生S1P的代谢产物。利用微量敏感的质谱仪测定alk-SMase KO鼠的肠道黏膜和肝组织中的鞘磷脂代谢产物含量，结果显示，①SM的含量变化：虽然与WT比较没有统计学的显著差异，但在KO鼠的小肠、结直肠黏膜以及肝组织中的SM含量均有所增加，分别增加35 pmoL/mg（8%），34 pmoL/mg（6%），29 pmoL/mg（6%）；②Cer的含量变化：在KO鼠的小肠、结直肠黏膜以及肝组织中的Cer含量均降低，分别降低38 pmoL/mg（18%），24 pmoL/mg（13%），4 pmoL/mg（3%），其中小肠黏膜的Cer含量减少与WT比较有显著的统计学差异，P＜0.05。③S1P的含量变化：在KO鼠的小肠、结直肠黏膜以及肝组织中的S1P含量明显增加，分别增加14 fmoL/mg（38%），13 fmoL/mg（34%），5 fmoL/mg（18%），其中肠黏膜的S1P含量增加与WT比较有显著的统计学差异，P＜0.05（见图5）。

注：HE染色图片代表来自10只不同基因型鼠组织。bar=250μm。图3 不同基因型小鼠肝肠组织形态学比较，×200Note.Representativemicrographs of HE stained slideswere taken from 10 littermates of identified genotypes ofmice，respectively.The bars inserted in the images indicate 250μmFig.3 Morphological comparison among 3 types of genotype of alk-SMase KO mice

注：免疫荧光染色图片代表WT（+/+）、杂合子（+/ˉ）及KO（ˉ/ˉ）不同基因型鼠的肠壁组织。绿色为alk-SMase蛋白，蓝色为细胞核（DAPI阳性）。在KO（ˉ/ˉ）肠黏膜上alk-SMase的表达明显减弱。标尺100μm。图4 alk-SMase在不同基因型鼠肠黏膜上的表达，×400Note.Representativemicrographs of alk-SMase immunofluorescence staining from the littermates of identified genotypes with WT（+/+），heterozygous（+/ˉ）and KO（ˉ/ˉ），respectively.Green color indicates positive alk-SMase expression，and blue indicates cellnuclei（DAPI+）.The alk-SMase expression was down-regulated in KO（ˉ/ˉ）intestine.The bars inserted in the images indicate 100μm，×400Fig.4 alk-SMase expression in the intestinalmucosa of identified genotype ofmice.

注：A、B、C分别为在小肠、结直肠、肝脏中鞘磷脂代谢物SM、Cer、S1P含量的质谱仪分析统计图，其中SM和Cer的值来自WT（+/+）及KO（ˉ/ˉ）各10只（n=10），S1P的值来自WT及KO各7只（n=7），3次独立的实验。柱形图代表平均值±标准误，*P＜0.05。图5 alk-SMase KO鼠肝肠组织中鞘磷脂代谢产物含量的质谱仪分析Note.The histograms in A，B，C represent the levels of sphingolipids metabolites SM，Cer，S1P in the intestine and liver tissues of alk-Mase WT（+/+）and KO（ˉ/ˉ）mice，which were detected by mass spectrometry.Analysis data were from n=10 in both SM group and Cer group，respectively，n=7 in S1P group，respectively.3 independent experiments，mean±SEM，*P＜0.05.Fig.5 SM，Cer，S1P levels detected by MS in the intestine and liver ofWT and KOmice

3 讨论

早在1969年瑞典医学家尼尔森就发现肠道中存在alk-SMase酶［6］，然而直到20世纪90年代才被广泛研究，2011年才见有alk-SMase基因剔除鼠模型的报道［3］。研究表明，alk-SMase的特性具有①组织表达特异性，alk-SMase仅分布于肠道微绒毛膜上（除人的胆汁外）；②胆汁盐依赖性，其酶活性需要胆盐的存在；③胰酶消化抵抗性，这就保护了酶的高稳定性等［1］。alk-SMase最主要的功能是水解SM，肠腔内SM在alk-SMase酶作用下水解成Cer，Cer又在神经酰胺酶的作用下进一步水解成鞘氨醇（sphingosine，Sph），Sph在鞘氨醇激酶作用下磷酸化成S1P。Cer、S1P有第二信使的作用，两者的平衡调节参与了调控细胞的增生、凋亡，抗炎、新生血管形成等过程［7，8］。近年研究表明，alk-SMase基因剔除鼠化学性诱发结肠癌的发生率高于野生型［4］，提示alk-SMase在结肠炎和结肠癌的发生发展中起着重要作用。

虽然alk-SMase基因剔除鼠已被用于研究，但该动物本身的背景特征尚需阐明，这对于今后研究结肠癌发生的诱因、病理机制和抗癌药的使用是很有必要的。基于这个目的，我们从瑞典隆德大学引进了alk-SMase基因剔除的小鼠，并在SPF级实验动物中心饲养繁殖，利用形态学方法、PCR以及质谱仪技术对动物的子代进行基因鉴定，表型观察以及代谢物含量的测定，发现从外观、毛色和体重看，KO与WT小鼠没有区别，但它们的基因型和肠道表型有明显的区分。KO鼠因在alk-SMase基因上剔除了一个外显子，使序列长度减少，所以基因鉴定条带上的分子量比WT的小［3］，导致alk-SMase在肠道的表达下调。由于alk-SMase缺失引起SM的消化障碍，出现抗细胞增殖和促凋亡的Cer生成减少，而与Cer相抗衡的S1P增多，导致肠道细胞增生，肠壁增厚（这点在我们的HE染色结果中得到证实），甚至诱发癌症［4］。

综上所述，alk-SMase KO鼠有明显的alk-SMase功能缺失背景，在无诱因之下，不影响鼠的一般健康状态，与正常鼠相似，但是它们可能是结肠癌发生的易感高危鼠群。因此，本研究通过实验阐明了alk-SMase KO鼠的特征，为进一步利用该动物模型作为研究工具，对alk-SMase的功能尤其是在结肠癌发生发展中的作用及其机制的探讨提供了有价值的实验数据。

［1］ Duan RD.Alkaline sphingomyelinase：An old enzyme with novel implications［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1761（3）：281 ˉ291.

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［3］ Zhang Y，Cheng YJ，Hansen GH，etal.Crucial role of alkaline sphingomyelinase in sphingomyelin digestion：a study on enzyme knockoutmice［J］.JLipid Res.2011，52（4）：771ˉ781.

［4］ Chen Y，Zhang P，Xu S，et al.Enhanced colonic tumorigenesis in alkaline sphingomyelinase（NPP7）knockoutmice［J］.Mol Cancer Ther，2015，14（1）：259ˉ267.

［5］ Zhao Z，Xu Y.An extremely simplemethod for extraction of lysophospholipids and phospholipids from blood samples［J］.J Lipid Res，2010，51：652ˉ659.

［6］ Nilsson A.The presence of sphingomyelin-and ceramide-cleaving enzymes in the small intestinal tract［J］.Biochim Biophys Acta，1969，176：339ˉ347.

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［8］ 覃蒙斌，黄杰安.鞘氨醇激酶-1在结肠癌中的作用研究进展［J］.国际消化病杂志，2009，29（1）：26ˉ28.

Genotypic and phenotypic characteristics of alkaline sphingom yelinase knockoutm ice

YANG Li-ping1*，ZHU Shun-xing2，Min Ya-lan1，LIU Huan-liang1，QIAN Hong-yan1Chen Yuan1，Zhu Jing-ye1，Shao Jing-jing1，LUO Run-hua1，LIJing1，Duan Rui-dong3
（1.Key Laboratory，Cancer Research Center，Nantong University，Nantong Juangsu 226361，China；2.Animal Research Facility in Nantong University，Nantong Juangsu 226001；3.Gastroenterology&Nutrition Laboratory，Lund University，Lund，Sweden S-22184）

ObjectiveTo determine the genotypic and phenotypic characteristics of alkaline sphingomyelinase（alk-SMase）knockout（KO）mice and to provide the foundation data of this animalmodel for further study of the role of alk-SMase in colon cancer.M ethodsDNA was extracted from the tail tissue ofwild type，heterozygous，homozygous KO mice，respectively.PCR analysis was used for genotyping.HE staining，confocalmicroscopy，and mass spectrometry were used for the detection ofmorphology，alk-SMase expression and sphingolipid metabolites in liver and intestine of themice.Resu ltsCompared with the wild type and heterozygousmice，the homozygous KO mice showed that no changes occurred in the appearance and body weight，there was only one band（247bp）appeared on the genotyping，the thickness in small intestinalmucosawas significantly increased with a lower expression level of alk-SMase，and the amountof sphingolipidmetabolites in the intestine and liver was changed，i.e.increase of SM and S1P，and reduction of ceramide.ConclusionsOur findings demonstrate that the homozygous KO mice have specific genotype and phenotype that do not affect their growth.Thesemice will provide an ideal animalmodel for further study of alk-SMase functions.

alk-SMase；Knockoutmouse；Genotype；Phenotype

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0495-05

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.010

2015-04-16

江苏省创新创业人才基金（项目号：苏人才2013ˉ41）。

杨俐萍（1958ˉ04），女，博士，教授，主要从事肿瘤标志物研究，E-mail：liping.yang@ntu.edu.cn