隐匿性HBV感染在多发性骨髓瘤发病中的作用研究*

王琦侠 倪庆仁 戴进前 郭亮 谢佳 任婧婧

近年来，多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的发病率逐年上升［1］。MM是发生于终末分化阶段B细胞（浆细胞）的恶性淋巴瘤，以骨髓中大量浆细胞克隆性增生为显著特征。到目前为止，其确切的发病危险因素仍不清楚，但是既往研究表明，MM的发生与环境和遗传因素均有关联［2］。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染和复制已被证实是肝癌主要病因之一。隐匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）是指患者血清中HBsAg阴性却可用敏感的技术在其外周血、肝脏等组织中检测到HBV DNA的存在［3］。最近有一些临床和流行病学研究发现，HBV感染可能也是MM发病的重要危险因素之一［4-6］。然而，既往有关MM发病危险因素的研究尚未见有与HBV隐匿性感染相关的报道。本研究采用病例对照研究方法，通过OBI的检测和分析，试图探讨HBV隐匿性感染在MM发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

将2010年10月至2014年10月西安市中心医院、陕西省人民医院、西安市交通大学西北医院等5所三级甲等医院新发的MM患者连续纳入病例组。所有患者均依照《中国多发性骨髓瘤诊治指南（2008）》标准诊断，ISS（international staging system）分期按国际骨髓瘤工作组（IMWG）标准。收集患者完整的实验室检查资料，主要包括骨髓穿刺结果、细胞遗传学检测结果、免疫表型、血常规、肝肾功能、β2-微球蛋白、血清轻链及影像学检查结果等。在上述不同医院随机选择对照组，要求与MM病例组在性别上一致、年龄相差±5岁的同期住院非肿瘤患者。所有研究对象均采集外周血5 mL，分离血清-80℃冻存备检，并签署知情同意书。本研究已通过西安市中心医院医学伦理委员会审批。

1.2 检测方法

1.2.1 外周血HBsAg检测 HbsAg检测采用酶联免疫法（北京万泰生物技术有限公司），具体操作按试剂盒说明书进行。HBsAg结果判断：样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1则判断为阳性，否则为阴性。

1.2.2 外周血OBI检测 1）磁珠法提取HBV DNA血清HBsAg阴性者的HBV DNA提取采用磁珠法（长春市志昂生物科技有限公司），具体操作按试剂盒说明书进行。先加入样本血清200 μL，在King Fisher DUO自动提取仪（美国Thermo Fisher公司）中提取30 min，最终提取产物约45 μL。2）巢式PCR扩增S区、C区采用多重巢式PCR法检测外周血清中HBV DNA基因组中的S区（S1、S2、S3、S4）、C区（C1、C2、C3、C4）基因编码区片段，扩增引物见表1。巢式PCR分别扩HBV DNA的PCR扩增体系总体积50 μL，包括 23 μL 水，5 μL 10×PCR buffer（含 15 mmol/L Mg⁃Cl2），4 μL 10 mmol/L dNTP，1.5 μL上、下游引物（S1、S2/C1 和 C2），0.3 μL EX-Taq 酶，和 15 μL DNA 模板。扩增条件为预变性94℃ 40 s；变性94℃30 s，55℃ 50 s，72℃ 60 s，循环35次；72℃ 5 min。取第1次PCR反应产物5 μL进行第2次扩增，反应条件与第1次反应相同。产物经1%琼脂糖凝胶电泳。采用HBV DNA阳性血浆和阴性血浆作为对照。判断标准：S区和C区片段扩增均为阳性者，判定为隐匿性HBV 感染［7］。

1.3 统计学方法

所有数据使用EpiData软件建立数据库双录入，采用 SPSS 16.0统计学软件（SPSS Inc，Chicago，Illi⁃nois，USA）进行统计学分析。组间率的比较用χ2检验或Fisher精确概率法；HBV与MM发病的关系分析采用Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人口学特征

MM病例组（185例）和对照组（182例）人群在性别、年龄、受教育程度、婚姻状况及其居住地方面的差异均无统计学意义（均P＞0.05，表2）。

表1 巢式PCR检测OBI的引物序列Table 1 Primer sequences of nested PCR for OBI detection

表1 巢式PCR检测OBI的引物序列（续表1）Table 1 Primer sequences of nested PCR for OBI detection

2.2 HBV感染与MM发病的关联分析

185例MM患者中HBsAg阳性者15例（8.1%），182例对照组8例（4.4%），两组间差异无统计学意义（χ2=2.58，P＞0.05）；OR 值 为 2.58（95%CI：0.84～4.49），P＜0.05；170例HBsAg阴性的MM患者中OBI感染者6例（3.5%），174例对照组中1例（0.6%），两组间差异均无统计学意义（P＞0.05）；OR值为6.44（95%CI：0.77～64.06），P＜0.05。

将HBsAg阳性者与OBI阳性者合并，MM组HBV感染率为11.35%（21/185），对照组为4.95%（9/182），两组HBV总感染率存在显著性差异（χ2=5.02，P＜0.05）。OR值为2.46（95%CI：1.10～5.53），P＜0.05，见表3。

2.3 MM患者感染HBV与否的临床特征比较

在MM患者中，HBV感染者与未感染者之间在性别和年龄未见有明显差异（均P＞0.05）；但在ISS分期中，HBV感染者Ⅲ期的比例明显高于未感染HBV组（85.7%vs.60.4%，χ2=5.15，P＜0.05）。实验室指标中，血红蛋白在两组间未见明显差异，白蛋白在感染者中较未感染者明显减低（χ2=5.60，P＜0.05），κ/λ轻链比值在感染组也明显低于未感染组（P＜0.05，表4）。

表2 MM病例组与对照组的均衡性检验 n（%）Table 2 Balance test of MM patients(185 cases)and control group(182 cases)

表3 HBV不同感染情况与MM患者发病的关系Table 3 Relationship between HBV infection and MM incidence

表4 MM患者中HBV感染的临床特征 n（%）Table 4 Clinical characteristics of HBV infection in patients with MM

表4 MM患者中HBV感染的临床特征（续表4）Table 4 Clinical characteristics of HBV infection in patients with MM

3 讨论

MM的病因目前尚无定论。多年来流行病学与临床研究均表明，MM的发病和其他肿瘤一样与诸多危险因素有关，如肿瘤家族史、肥胖、特殊职业暴露史、饮食习惯、吸烟、饮酒及染发等［8-10］，是多病因交互作用所致。最近有一些临床和流行病学研究发现，HBV感染可能也是MM发病重要的危险因素之一［3-5］。但国内外一些研究结果相互矛盾，2012年Becker报道了在欧洲6个国家进行的淋巴瘤多中心病例对照研究，在187例MM患者中，通过检测HBsAg、抗-HBc和抗-HBs来区分病例和对照组的HBV当前或过去感染和免疫接种情况，发现过去曾有HBV感染与MM发病呈正相关（OR=1.97，95%CI：1.16～3.37）［5］；在我国2012年也有研究报道发现MM患者HBsAg阳性率明显高于急性白血病患者（19.4%vs.12.0%，P=0.014）［11］，提示HBV感染可能在MM发病中发挥着重要作用。王立茹等［12］对363例MM患者进行回顾性研究，血清检测结果发现HBsAg阳性率显著高于健康体检者感染率（4.4%vs.2.4%，P=0.015）；但倪芳等［13］检测了198例MM患者乙肝五项及HBV-DNA定量，HBsAg阳性率与对照组之间的差异无统计学意义（2.6%vs.3.4%，P＞0.05）。本研究结果也显示，MM患者与对照组HBsAg阳性率之间的差异无统计学意义。但若将HBV隐匿性感染纳入分析，结果则表明MM患者HBV的总感染率明显高于对照组（P＜0.05），而且感染HBV发生MM的风险是未感染者的2.46倍（OR=2.46）。

既往研究表明HBV整合于宿主细胞基因组是免疫逃避的机制之一，也是HBV在体内长期存在的重要原因。HBV除了能整合于肝细胞，还能整合于外周血免疫细胞之中，并影响细胞功能［14］。有研究发现，尽管OBI病毒载量很低（≤100 IU/mL），但可导致细胞DNA损伤、氧化应激和凋亡增加［15］。该研究认为OBI的主要机制是由于HBV整合到宿主的基因组中并在外周血单核细胞（PBMC）中持续存在。OBI对MM发病的影响在既往的研究中未见报道，本研究结果提示对研究对象开展OBI检测可以更加准确地反应其HBV感染情况。因此，综合这些研究结果说明OBI可能在MM发病中起着一定的作用，值得深入开展研究。需要指出的是，由于本研究采用的是回顾性的病例对照研究设计，尚须进一步采用前瞻性研究和实验研究以验证HBV隐匿性感染与MM之间的因果关联性。

MM患者中有HBV感染者较未感染者伴有更多细胞遗传学异常、肝功能异常和较差的生存期［16］。本研究也发现伴有HBV感染的Ⅲ期MM患者所占比例较高；与此同时，和ISS分期同样有预后判断价值的κ/λ轻链比值在HBV感染者较未感染者中减低，亦提示感染者预后较差［17］。本研究结果还显示，伴有HBV感染的MM患者肝脏功能受损，其原因可能是MM的化疗中一般都包括糖皮质类固醇激素，这可能会导致HBV再激活，加重肝功能的损害，甚至爆发重症肝炎而威胁生命。因此，对于已感染HBV的MM患者应在化疗前开始预防性应用抗病毒复制的药物，以有效地预防HBV再激活［18］，尤其是要对HBsAg阴性的MM患者在化疗前也应开展OBI的筛查，避免出现HBV再激活而影响生存期。

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