淮山药灌胃预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

洪志华周 云

淮山药灌胃预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

洪志华1周 云2

目的 探讨淮山药灌胃预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的可能保护作用。方法 48只3～4周龄雄性SD大鼠随机分为缺血再灌注淮山药灌胃预处理组（淮山药组，n=24）和缺血再灌注无菌生理盐水灌胃对照组（生理盐水组，n=24）。淮山药组、生理盐水组在缺血再灌注损伤前连续灌胃5天。分别于再灌注损伤后2、12、24、48h四个时间点随机选淮山药组、生理盐水组各6只大鼠再次手术行下腔静脉采血和收获肾脏标本。测定血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）以及血清丙二醛（MDA）含量。肾组织常规病理切片H-E染色光镜下参照Paller评分标准进行评分，TUNEL法检测细胞凋亡。结果 再灌注后12、24、48h，同时间点淮山药组与生理盐水组比较，其血清Scr、BUN含量显著下降 [BUN 12h：（15.30±2.60）mmol/L比（22.07±4.57）mmol/L，24h：（19.56±3.89）mmol/L比（34.75±6.32）mmol/L，48h：（14.72±2.99）mmol/L比（20.16±2.40）mmol/L；Scr 12h：（56.38±8.70）μmol/L比（98.72±12.37）μmol/L，24h：（81.53±10.17）μmol/L比（128.52±17.30）μmol/L；48h：（55.01±9.71）μmol/L比（80.72±11.13）μmol/L；P＜0.05，P＜0.01]。再灌注后2、12、24h，淮山药组血清MDA含量较同时间点生理盐水组显著下降[2h：（4.74±0.50）nmol/L比（7.45±1.03）nmol/L，12h：（6.19±0.68）nmol/L比（10.52±1.57）nmol/L，24h：（5.16±0.58）nmol/L比（6.93±1.32）nmol/L；P＜0.05，P＜0.01]。肾组织学评分于再灌注后12、24、48h，同时间点淮山药组较生理盐水组有显著减低 [12h：（7.50±0.55）分比（8.50±0.55）分，24h：（6.17±0.75）分比（7.50±1.05）分，48h：（4.17±0.75）分比（5.50±1.05）分；P＜0.05]。再灌注后2h就有凋亡细胞出现，12h时可见大量凋亡细胞脱落到肾小管腔中，此时间点淮山药组凋亡细胞数较生理盐水组明显减少[（10.17±2.14）个/HPF比（13.67±2.94）个/HPF，P＜0.05]。结论 淮山药灌胃预处理可以减轻缺血再灌注模型大鼠肾组织氧化损伤和减少肾小管上皮细胞凋亡的发生，降低血清Scr、BUN和MDA水平，有效保护肾功能。

大鼠；肾脏；缺血再灌注损伤；淮山药；灌胃预处理

肾缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是急性肾功能衰竭发生主要原因之一。其损伤机制复杂，涉及氧自由基氧化损伤作用、钙超载、能量代谢障碍、细胞凋亡等多种因素，目前缺乏有效地防治手段。山药是最常用的中药之一，药理作用有抗衰老；抗氧化、抗自由基活性等[1-2]。本实验制备大鼠肾缺血再灌注损伤模型，通过对肾组织形态学、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）和凋亡的测定，探讨淮山药对肾IRI的影响及其临床防治意义。

1 材料与方法

1.1 药物及动物 48只3～4周健康雄性SD大鼠，体质量90～110g，由苏州大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（苏）2002-0008。术前予自由采食饮水、恒温恒湿等规范化饲养。

1.2 药物及试剂 淮山药（江阴天江药业有限公司生产，批号05707107），MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所），原位凋亡试剂盒（德国Boehringer公司）。

1.3 分 组 48只健康雄性SD大鼠，随机数字表法随机分为缺血再灌注淮山药灌胃预处理组（淮山药组，n=24）和缺血再灌注无菌生理盐水灌胃对照组（生理盐水组，n=24）。

1.4 模型制备前处理 淮山药组大鼠模型制备前予淮山药灌胃，浓度0.5g/mL、剂量20mL/kg，连续5天；生理盐水组大鼠模型制备前予生理盐水灌胃，剂量为20mL/kg，连续5天。术前均在苏州大学医学院动物实验中心饲养（环境温度24～26℃，相对湿度50%～ 65%），可随时采食和饮水。

1.5 模型制备 两组大鼠术前12h禁食，不禁水（手术室温度25～28℃，相对湿度55%～60%），1%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒、铺巾，正中腹部切口，游离双侧肾蒂血管。用无损伤动脉夹阻断双肾血流45min后恢复血流，关闭腹腔。术后亦均在苏州大学医学院动物实验中心饲养，可随时采食和饮水。

1.6 标本采集 两组分别于开放血流再灌注后2、12、24、48h四个时间点，每个时间点随机选取两组各6只大鼠，再次手术，原切口进腹采血和收获肾脏标本待测。

1.7 检测指标和方法 血液标本在全自动生化分析仪上测血清Scr和BUN；应用MDA试剂盒，通过硫代巴比妥酸盐法检测血清MDA值；肾组织常规病理切片H-E染色光镜下参照Paller[3]评分标准进行评分；原位凋亡试剂盒TUNEL法检测细胞凋亡。

2 结果

2.1 淮山药组、生理盐水组血清BUN、Scr指标比较

缺血再灌注损伤后大鼠血清BUN、Scr水平均有不同幅度的上升。淮山药组于12、24、48h血清BUN、Scr水平较同时间点生理盐水组降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表1～2。

表1 两组血清尿素氮（BUN）比较（mmol/L，±s）

表1 两组血清尿素氮（BUN）比较（mmol/L，±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

生理盐水组淮山药组6 6 7.08±1.00 6.09±0.70 22.07±4.57 15.30±2.60* 34.75±6.32 19.56±3.89** 20.16±2.40 14.72±2.99*

表2 两组血清肌酐（Scr）比较（μmol/L，±s）

表2 两组血清肌酐（Scr）比较（μmol/L，±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

生理盐水组淮山药组6 6 46.80±3.69 34.23±5.08 98.72±12.37 56.38±8.70** 128.52±17.30 81.53±10.17** 80.72±11.13 55.01±9.71*

2.2 淮山药组、生理盐水组血清MDA含量比较 缺血再灌注损伤后大鼠血清MDA水平均有不同幅度的上升。淮山药组于再灌注后2、12、24h，血清MDA的水平与同时间点的生理盐水组比较明显降低（P＜0.05，P＜0.01），见表3。

表3 两组血清丙二醛（MDA）比较（nmol/mL，±s）

表3 两组血清丙二醛（MDA）比较（nmol/mL，±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

只数 缺血再灌注时间组别生理盐水组淮山药组6 6 2h 7.45±1.03 4.74±0.50** 12h 10.52±1.57 6.19±0.68** 24h 6.93±1.32 5.16±0.58* 48h 5.89±1.21 5.05±0.70

2.3 肾组织形态学评分比较 缺血再灌注损伤后大鼠肾组织均可见不同程度的损害征象：肾小管扩张、轮廓结构欠清、细胞变扁、胞质疏松着色浅、核浓缩空泡变性，肾小管内有脱落细胞及管型形成，间质炎性细胞浸润及充血（图1，封四）。淮山药组组织学评分于再灌注后12h、24h、48h较同时间点生理盐水组明显低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 两组肾组织形态学评分（分，±s）

表4 两组肾组织形态学评分（分，±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05

组别生理盐水组淮山药组只数 缺血再灌注时间6 6 2h 5.83±0.75 5.17±0.75 12h 8.50±0.55 7.50±0.55* 24h 7.50±1.05 6.17±0.75* 48h 5.50±1.05 4.17±0.75*

2.4 淮山药组、生理盐水组肾小管上皮细胞凋亡比较 细胞凋亡的形态学特点是细胞体积变小，胞膜气泡化，核固缩、核碎裂，细胞皱缩、胞质凝聚，“凋亡小体”形成，再灌注后2h就有凋亡细胞出现，12h时可见大量凋亡细胞脱落到肾小管腔中（图2，封四）。缺血再灌注后12h生理盐水组凋亡细胞数明显增加。缺血再灌注后12h淮山药组凋亡细胞数较生理盐水组有明显减少（P＜0.05），见表5。

表5 两组TUNEL染色阳性细胞数（个/HPF，±s）

表5 两组TUNEL染色阳性细胞数（个/HPF，±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05

生理盐水组淮山药组6 6 13.67±2.94 10.17±2.14*

3 讨 论

组织、器官缺血一段时间，当血流重新恢复后细胞功能代谢障碍及其结构损坏的程度较缺血时进一步加重，称之为缺血再灌注损伤。肾脏作为高灌注器官，对缺血缺氧比较敏感，非常容易发生缺血再灌注损伤。造成肾缺血再灌注损伤的相关因素很多，研究[4]表明，肾缺血再灌注损伤时氧自由基大量产生，自由基能使生物膜的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化而生成脂质过氧化物，脂质过氧化物分解时产生MDA能使DNA、蛋白质发生交连造成细胞损伤。血清MDA水平可间接反应组织中自由基含量及脂质过氧化程度，显示氧自由基对于机体细胞受攻击的程度[5]。许多实验研究表明[6-10]，中药可减少氧自由基的生成，降低过氧化脂质，抑制细胞凋亡，因此具有减轻缺血再灌注引起的组织损伤。缺血再灌注后2、12、24h，淮山药组大鼠血清MDA水平较同时间点生理盐水组有明显的降低（P＜0.05，P＜0.01）。显示肾功能的血清BUN、Scr水平，在缺血再灌注淮后12、24、48h淮山药组与同时间点生理盐水组相比也有明显的差异（P＜0.05，P＜0.01）。光镜下组织学的评分显示淮山药组大鼠肾组织较同时间点生理盐水组大鼠肾组织损伤程度轻（P＜0.05）。以上均表明淮山药通过抗氧化、抗自由基活性等减轻了肾缺血再灌注损伤，有效保护肾功能。也有报道[11]山药多糖通过上调肾组织缺氧诱导因子-1α表达进而诱导血管内皮生长因子的表达，改善缺血再灌注肾组织缺血缺氧，从而保护肾功能。这可能是山药多糖防治肾缺血再灌注损伤的又一机制。

本实验中我们通过对凋亡细胞的检测，同样发现肾脏发生缺血再灌注损伤后其肾组织中有大量的凋亡细胞出现，缺血再灌注损伤后12h，淮山药组的凋亡细胞数较生理盐水组明显减少，说明淮山药灌胃预处理可以减少肾缺血再灌注损伤后肾小管细胞凋亡的发生，其机制有待进一步研究。

本研究发现淮山药灌胃预处理可以预防和减轻肾组织氧化物损伤程度、减少细胞凋亡，从而有效地保护了肾功能。近年来，应用中草药促进血管再生研究取得了一定成效。中草药治疗脏器缺血性疾病疗效明显，促血管再生可能是其作用主要机制之一。淮山药是否也能够通过促进肾脏血管再生，减少肾脏再灌注后期的无灌流现象，加速肾组织的修复，也有待进一步研究。

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（收稿：2014-12-11 修回：2015-03-09）

Protective Effect of Pretreatment w ith Rhizome Dioscoreae Lavage on Renal Ischem ia-reperfusion Injury inRats

HONG Zhihua1,ZHOU Yun2. 1 Department of Pediatric Surgery,Jiaxing Maternity and Child Health Care Hospital,Jiaxing(314000),China;2 Department of Pediatric Surgery,Children's Hospital,Soochow University, Suzhou(215003),China

Objective To investigate the protective effect of pretreatment with Rhizome Dioscoreae on alleviating ischemia-reperfusion injury in rats.M ethods Fifty-four Spargue-Dawley rats were random ly divided into 3 groups: sham operation group（n=6）,ischemia-reperfusion group with pretreatment of Phizoma Dioscoreae via intragastric administration（Rhizoma dioscoreae group,n=24）,and ischemia-reperfusion group with aseptic normal saline lavege（aseptic saline group,n=24）.The rats in Rhizoma Dioscoreae group and aseptic saline group were pretreated with rhizoma Dioscoreae and placebo aseptic normal saline for 5d,respectively before being subjected to bilateral renal vascular occlusion for 45min.At 2,12,24 and 48h after reperfusion,every 6 rats in each group were random ly euthanized for blood sampling and kidney harvesting.The blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（Scr）and serum malondialdehyde（MDA）were measured.Renal morphologic changes were scored with Paller's criterionon hematoxylin and eosin（HE）stained sections.Renal tubular cell apoptosis were detected with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling procedure（TUNEL）.Results After 12,24,and 48h of reperfusion,the Scr and BUN value in Rhizoma Dioscoreae group were significantly lower than those in aseptic saline group（BUN 12h:15.3±2.60mmol/L vs 22.07±4.57mmol/L,24h:19.56±3.89mmol/L vs 34.75±6.32mmol/L,48h: 14.72±2.99mmol/L vs 20.16±2.40mmol/L;Scr 12h:56.38±8.72mmol/L vs 98.72±12.37mmol/L,24h:81.53± 10.17mmol/L vs 128.50±17.30mmol/L,48h:55.01±9.71mmol/L vs 80.72±11.13mmol/L;P＜0.05 or P＜0.01).At 2,12, and 24h,the serum content of MDA in Rhizoma Dioscoreae group were significantly lower than those in aseptic saline group（2h:4.74±0.50nmol/L vs 7.45±1.03nmol/L,12h:6.19±0.68nmol/L vs 10.52±1.5nmol/L,24h:5.16± 0.58nmol/L vs 6.93±1.32nmol/L;P＜0.05 or P＜0.01）.Renal apoptosis score at 12,24,and 48h of reperfusion in Rhizoma Dioscoreae group were less than that in aseptic saline group（12h:7.50±0.55 vs 8.50±0.55,24h:6.17±0.75 vs 7.00±1.05;48h:4.17±0.75 vs 5.50±1.05;P＜0.05）.The tubular cell apoptosis was detected in the kidney at 2h after ischemia-reperfusion injury and reached the highest level at 12h（Rhizoma Dioscoreae group 10.17±2.14/HPF vs aseptic saline group 13.67±2.94/HPF,P＜0.05）.Conclusion The pretreatment of Rhizoma Dioscoreae lavage in rats results in lessening the oxidative damage and apoptosis,lowering the level of Scr,BUN and MDA,thereby protecting kidney from ischemia-reperfusion injury.

rats;kidney;ischemia-reperfusion injury;Rhizoma Dioscoreae;lavage

1浙江省嘉兴市妇幼保健院外科（嘉兴 314000）；2江苏省苏州市儿童医院小儿泌尿外科（苏州 215003）

周云，E-mail：cloudyzy@jsmail.com.cn