藏红花有效成分含量比较与相关性研究

朱芳萍 吕伟旗 张青莲 吴春美

藏红花有效成分含量比较与相关性研究

朱芳萍 吕伟旗 张青莲 吴春美

目的 比较藏红花有效成分含量及影响因素，为藏红花高产优质栽培与优良种质选育提供依据。方法 在2010年版药典与现有文献基础上，优化藏红花有效成分含量HPLC测定方法，并测量比较11个产地藏红花中有效成分含量，用DPS软件分析经纬度、海拔与有效成分含量间的相关性。结果 西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ分别在6.236～62.356μg/mL以及3.158～31.584μg/mL范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系，R2分别为0.9997与0.9996，两者平均回收率分别为99.9%（RSD=1.69%，n=9）与99.4%（RSD=0.86%，n=9）；11个产地藏红花中西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、西红花总苷含量存在显著差异（P＜0.05，P＜0.01）；经度与西红花有效成分含量呈正相关关系，海拔、纬度与西红花有效成分含量呈负相关关系。结论 本方法测定藏红花有效成分含量简便、准确、重复性好，我国引种的藏红花有效成分含量高，质量好，低纬度、高经度地区并视种质选择海拔高度区别种植藏红花有利于有效成分积累。

藏红花；有效成分；含量；相关性

藏红花crocus sativus L.学名西红花、番红花，系鸢尾科番红花属植物，原产西班牙、伊朗等地，因其经印度转入西藏再销往国内各地而得名[1]。花柱上部及柱头入药，具有强烈的活血化瘀和散郁开结之功效，是有效的妇科良药，治疗妇女闭经、产后瘀血腹痛有独特疗效[2-4]。西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ是2010年版《药典》规定的藏红花主要有效成分，药理学研究表明，藏红花具有改善微循环，提高免疫力，抗动脉硬化，抗氧化，降血脂，利胆保肝，防治骨质疏松，保护肾脏等功效[5-10]。藏红花在我国浙江、河南、上海、江苏、新疆、西藏等地均有栽培，因栽培地南北跨度大，不同产地栽培的藏红花在物候期、农艺性状、有效成分含量等方面存在差异。笔者收集了全国主要产区11批样品，采用HPLC法对不同产地藏红花进行西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量测定，并分析了经纬度、海拔与有效成分含量间的相关性，以期为藏红花高产栽培与质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Waters1525高效液相色谱仪：1525μ泵、2487双波长紫外检测器、7725Ⅰ型手动进样器、Breeze3.0版的色谱工作站（美国Waters公司）；KQ5200DE型数控超声清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司，机型：Milli-Q Academic）；DGG-9070型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

西红花苷-Ⅰ对照品（Crocin-Ⅰ，纯度＞97%，成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-11071108）；西红花苷-Ⅱ对照品（Crocin-Ⅱ，纯度＞98%，成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-11091002）；甲醇（色谱级，德国Merck公司）；乙醇（分析级，安特公司）；水为去离子水，其它试剂均为分析纯。供试药材2012年10月—2012年11月采自浙江、江苏、河南、上海等不同产地，经丽水市人民医院副主任药师吴春美鉴定为鸢尾科番红花属植物番红花crocus sativus L.的柱头，详见表1。

表1 供试不同产地藏红花药材统计

1.2 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱Agligent eclipse XDB-C18（4.6mm×250mm，4.6μm）；流动相为甲醇∶水（48∶52，V/V），采用等度洗脱条件，时间为45min；流速：1.0mL/min；检测波长：440nm；柱温：35℃；进样量：20μL。按上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪。

1.3 溶液制备

1.3.1 对照品溶液的制备 分别精密称取西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ对照品适量，置25mL容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀。得浓度为0.624mg/mL的西红花苷-Ⅰ对照品溶液和0.316mg/ mL的西红花苷-Ⅱ对照品溶液，置于4℃冰箱避光保存，备用。

1.3.2 供试品溶液的制备 取本品粉末10mg，置25mL容量瓶中，加适量50%乙醇溶解，40℃超声处理30min，放至室温，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔膜滤过即得。

1.4 线性关系考察 分别取对照品西红花苷-Ⅰ（0.624mg/mL）与西红花苷-Ⅱ（0.316mg/mL），移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL容量瓶中，加50%乙醇稀释定容，在“1.2.1”色谱条件下测定。以西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ对照品溶液的质量浓度为纵坐标x，峰面积为横坐标y绘制标准曲线。计算得西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ线性范围分别为6.236～62.356μg/mL以及3.158～31.584μg/mL，回归方程以及相关系数分别为：y=388.87x-33.547，R2=0.9997；y=392.94x-144.5，R2=0.9996，见表2。

1.5 稳定性试验 取8号样品，按“1.2.2.2”方法制备供试品溶液，放入适宜的开口容器中，置于以下条件保存：①高温度试验：40℃，避光；②高湿度试验：室温，相对湿度（90±5）%，避光；③强光照射试验：室温，（4500±500）Lux光照强度下照射。分别于0、2、4、6、8、10、12、24进样，在“1.2.1”色谱条件下测定峰面积，计算得各条件下西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ峰面积的RSD（n=8）值，结果表明供试品溶液在强光照射条件下不稳定，在高温度、高湿度避光保存条件下24h内稳定，见表3。

1.6 精密度试验 取同一标准品溶液，在“1.2.1”色谱条件下连续进样5次，测得西红花苷-Ⅰ的色谱峰面积RSD=0.88%，西红花苷-Ⅱ的色谱峰面积RSD= 1.67%，表明仪器精密度良好，见表4。

表2 西红花苷-Ⅰ与西红花苷-Ⅱ线性关系考察

1.7 重复性试验 取8号样品5份，按“1.2.2.2”供试品溶液的制备操作，在“1.2.1”的色谱条件下测定含量，得西红花苷-Ⅰ的平均含量为10.88%，RSD为1.28%，西红花苷-Ⅱ的平均含量为3.53%，RSD为1.24%，见表5。

1.8 加样回收率试验 取已知西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量的西红花样品10mg，9份，分低、中、高三组，每组3份，分别加入西红花苷-Ⅰ（0.624mg/ mL）对照品溶液各0.90，0.75和0.50mL；西红花苷-Ⅱ（0.316mg/mL）对照品溶液分别加入0.49、0.41和 0.33mL，按照“1.2.2.2”供试品溶液的制备操作，按“1.2.1”色谱条件进样测定，计算回收率（%）=（C-A）/ B×100%，A为样品中被测成分的含量，B为加入对照品的量，C为实际测得含量。结果见表6，西红花苷-Ⅰ的平均回收率为99.9%，RSD为1.69%；西红花苷-Ⅱ的平均回收率为99.4%，RSD为0.86%。

1.9 样品含量测定 精密称取样品适量，按“1.2.2.2”供试品溶液的制备操作，在“1.2.1”的色谱条件下对不同产地11个藏红花样品进行西红花苷含量测定，重复3次，计算总苷含量=西红花苷-Ⅰ含量+西红花苷-Ⅱ含量。

表3 稳定性试验

表4 精密度试验

表5 重复性试验（%）

表6 加样回收率试验结果

2 结果与分析

2.1 藏红花有效成分含量HPLC法优化 分别对西红花苷-Ⅰ与西红花苷-Ⅱ色谱峰进行吸收光谱扫描，结果发现西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ色谱峰在440nm波长处有最大吸收，与2010年版《药典》中西红花苷-Ⅰ与西红花苷-Ⅱ的测定波长一致。因此，选择440nm作为西红花苷-Ⅰ与西红花苷-Ⅱ的检测波长。在现有研究基础上[8，11-13]，对西红花苷提取工艺进行了优化，分别考察了乙醇浓度为40%、50%、60%，提取时间为20、30、40min，提取温度为30、40、50、60℃对西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ提取含量的影响，结果表明，用50%乙醇，40℃条件下超声30min即可提取完全，且操作简便、快捷，供试品溶液中杂质成分含量低，不干扰待测成分的检验。同时比较了几种不同流动相比例，发现以甲醇：水=48：52（V：V）为流动相较好，选用的流动相条件使得西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ两个化合物的峰行好，出峰时间早，分离度好。色谱图见图1。

2.2 11个产地藏红花有效成分含量比较 不同产地藏红花中西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ与总苷含量存在差异（P＜0.05，P＜0.01），浙江产藏红花中西红花总苷含量较高，其中最高为浙江建德1样品，总苷含量达到18.48%，江苏与河南产藏红花中西红花总苷含量相对较低，江苏太仓与河南三门峡样品含量最低，总苷含量仅为12.35%，详见表7。我国藏红花主产地浙江、江苏、河南、上海所产藏红花中西红花总苷含量均达到2010年版药典要求（总苷含量不低于10.0%），总苷平均含量达14.92%。从有效成分含量看，我国引种藏红花较为成功，所产藏红花品质好，长江三角洲地区较适合藏红花选育栽培，为藏红花良种选育奠定了基础。

2.3 海拔、经纬度与有效成分相关性分析 产地的立地条件对中药材药效成分的积累具有一定影响，包括海拔、年平均气温、经纬度、光照等。本试验分析显示，藏红花产地海拔、经纬度与有效成分含量存在相关性，其中经度与西红花有效成分含量呈正相关关系，海拔、纬度与西红花有效成分含量呈负相关关系；纬度与有效成分含量间相关性最大，相关系数分别达到西红花苷-Ⅰ含量（0.61712）、西红花苷-Ⅱ含量（0.67684）、西红花总苷含量（0.67503），见表8。从各指标相关性看，低海拔、低纬度、高经度地区种植藏红花有利于有效成分含量积累。

表7 不同产地藏红花中西红花苷含量比较（%）

3 讨论

藏红花性平，味甘，归心、肝经，主要功效为活血化瘀，凉血解毒，解郁安神，用于经闭癓瘕，产后瘀阻，温毒发斑，忧郁痞闷，惊悸发狂。同时，藏红花又可用于开发功能性食品、天然色素、保健化妆品等，再次成为人们研究开发的热点，但是藏红花资源极其有限，致使价格昂贵，一直被誉为“植物黄金”。我国医药所需的藏红花主要依靠进口，虽然进行引种栽培，提供少量商品，但因种源少，适宜栽培的地区有限，栽培技术要求较高等综合因素，满足不了市场的需求，出现了供不应求的局面。收集我国藏红花主产区藏红花栽培资源，进行有效成分含量比较、经纬度等相关性分析，对筛选藏红花优良种质，高产优质栽培等研究均有重要意义。

图1 高效液相色谱图A.西红花苷-Ⅰ对照品；B.西红花苷-Ⅱ对照品；C.供试样品；1.西红花苷-Ⅰ；2.西红花苷-Ⅱ

表8 海拔、经纬度与有效成分含量相关性分析

实验结果表明，我国藏红花主产区所产藏红花中主要有效成分均符合2010年版《药典》中西红花总苷含量不得少于10%的要求；11个产地藏红花中西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ与总苷含量均存在显著差异（P＜0.05，P＜0.01），浙江产藏红花中西红花总苷含量较高，江苏与河南产藏红花中西红花总苷含量相对较低；经度与西红花有效成分含量呈正相关关系，海拔、纬度与西红花有效成分含量呈负相关关系。试验结果显示低海拔、低纬度、高经度地区种植藏红花有利于西红花总苷含量积累，但是低海拔地区藏红花进入盛花期时间往往比高海拔地区推迟半个月，这样反倒不利于产量的提高，也延迟了大田移栽期，减少了大田生长时间，不利于来年种球生长。因此，藏红花高产优质栽培需综合考虑干花成品、种球的质量与产量，同时结合栽培地不同立地条件与不同藏红花种质的特性多方面考虑。据笔者多年调查研究藏红花大田生长习性与室内开花习性，并结合本试验可知，我国长江中下游地区所产藏红花种质，种球生长所需大田应位于低纬度地区，室内培育开花场地应视具体种质而定，长江中下游种质室内培育开花位于中高海拔地区，而河南等北方种质应位于低海拔地区，这样可提高藏红花有效成分积累，增加种球质量与产量。

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（收稿：2014-08-06 修回：2014-11-18）

Com parison of the Active Com ponent Contents in Crocus Sativus and Their Correlation w ith Site Condi-tion

ZHU Fangping,LV Weiqi,ZHANG Qinglian,WU Chunmei.Department of Pharmacy,the Six Hospital affiliated to Wenzhou Medical University,Lishui(323000),China

Objective To detect the active component contents in Crocus sativus and investigate the influence factor on them,in order to provide scientific basis for high yield and quality cultivation of Crocus sativus and selection of good germ plasm.M ethods Based on China Pharmacopeia published in 2010 and the existing evidence, the HPLC method for determination of active component contents in Crocus sativus was optimized.The active component contents in Crocus sativus planted in 11 different producing area were determined and compared.DPS software was used to find the relationship between latitude,longitude,height,and the active components.Results The linear ranges of crorin-I and crorin-II were 6.236-62.356μg/mL and 3.158-31.584μg/mL,the R2 were 0.9997 and 0.9996,and the average recovery rates were 99.9%（RSD=1.69%,n=9）and 99.4%（RSD=0.86%,n=9）,respectively.Significant difference in crorin-I,crorin-II,and total contents was found between Crocus sativus produced in different areas（P＜0.05 or P＜0.01）.A positive correlation was seen between active component contents and the longitude of producing area;a negative correlation was seen between active component contents and the latitude and height of producing area.Conclusion The optimized HPLC method for determining the active component contents in Crocus sativus is convenient,accurate,and repeatable.The quality of Crocus sativus cultivated in China is high. Cultivation of Crocus sativus in areas with low latitude,high longitude and varied heights according to different germplasm will be benefit.

Crocus sativus;Active components;Content;Correlation

温州医科大学附属第六医院药剂科（丽水市人民医院）（丽水 323000）

吴春美，Tel：0578-2292513