乌司他丁对脑出血模型兔血清基质金属蛋白酶-9、半胱天冬氨酸蛋白酶-3的影响

佟丽妍胡才宝许 莉冯为民

乌司他丁对脑出血模型兔血清基质金属蛋白酶-9、半胱天冬氨酸蛋白酶-3的影响

佟丽妍1胡才宝2许 莉3冯为民1

目的 观察乌司他丁对脑出血模型兔血清基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的影响，探讨乌司他丁的脑保护作用。方法 将造模成功的20只新西兰兔随机分为脑出血模型组（模型组）和乌司他丁治疗组（治疗组），每组10只。分别给予生理盐水和乌司他丁注射液，静脉推注，共7天。应用ELISA法测定各组兔脑出血后第1、3、5、7天动脉血基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）含量。结果 与模型组比较，治疗第1天治疗组MMP-9[（951.72±216.35）ng/L]、Caspase-3[（58.11±5.07）μmol/mL]差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗第3、5、7天，治疗组MMP-9[分别为（887.02±205.77）ng/L、（892.79±123.94）ng/L、（858.90± 97.37）ng/L]及Caspase-3[分别为（58.00±4.99）μmol/mL、（49.05±9.30）μmol/mL、（48.22±10.28）μmol/ mL]含量均明显下降，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论 乌司他丁可下调脑出血模型兔血清MMP-9及Caspase-3含量，对脑出血具有一定的脑保护作用。

兔；脑出血；乌司他丁；基质金属蛋白酶-9；半胱天冬氨酸蛋白酶-3

脑出血（cerebral hemorrhage，CH）后出血灶周围脑组织水肿是导致继发性神经元损害的重要因素。其中主要为血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的破坏和神经细胞凋亡。研究[1]发现，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在脑组织损伤后明显升高，是导致血管源性脑水肿和继发性脑损伤的重要环节。半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）是凋亡信号传导途径中重要的调控基因[2]。乌司他丁（ulinastatin，UTI）是从人类尿液中提取精制而成的糖蛋白，具有抑制多种酶、稳定细胞膜和溶酶体膜，抑制溶酶体酶的活性及释放等作用。研究表明，UTI对缺血性再灌注后脑组织损伤具有脑保护作用，本实验旨在探讨UTI在脑出血方面的脑保护作用。

表1 两组血清MMP-9水平比较（ng/L，±s）

表1 两组血清MMP-9水平比较（ng/L，±s）

注：与模型组比较，△P＜0.05

组别模型组治疗组只数10 10 1d 1080.54±165.90 951.72±216.35 3d 1745.65±133.48 887.02±205.77△5d 1576.69±129.85 892.79±123.94△7d 1271.37±109.31 858.90±97.37△

1 实验材料

1.1 动 物 选用健康成年新西兰兔20只，雌雄不限，体质量（3.0±0.2）kg，由浙江省农业科学院提供，许可证号：SCXK（浙）2010-0047。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料及饮水，自主进食。温度（23± 10℃），湿度50%～70%，正常昼夜节律，噪音＜50dB，通风，单笼饲养。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2 药 物 乌司他丁注射液（规格：10万U/支，批号031301064）购自广东天普生化医药股份有限公司。兔基质金属蛋白酶9（MMP-9）酶联免疫检测试剂盒（R&D公司，批号Ra45991L）及兔半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）酶联免疫检测试剂盒（R&D公司，批号Ra34851L）均购自杭州达文生物有限公司。

2 实验方法

2.1 动物分组 将造模成功的20只新西兰兔根据随机数字表法随机平行分为脑出血模型组（模型组）和乌司他丁治疗组（治疗组），每组10只。

2.2 模型制备 将符合实验标准的新西兰兔，参照文献[3]的方法加以改良：以戊巴比妥钠（30mg/kg）耳缘静脉麻醉,头部剃毛,俯卧位固定于兔脑立体定位仪上。手术暴露颅骨十字缝和人字缝。参照Sawyer兔脑立体定位图谱确定内囊位置：AP1mm，R6mm，H13mm。选取十字缝交叉点为基点沿冠状缝向右旁开6mm再平行矢状缝向前1mm为穿刺进针点。在兔耳中央动脉采取自体未凝动脉血0.5mL，用9号腰穿针快速垂直于颅骨穿入脑实质，进针深度13mm，3min之内缓慢注入，停针5min后缓慢拔针。局部压迫止血，缝合皮肤，造模完成。

2.3 给 药 模型组造模成功后连续7天，予以生理盐水2mL，静脉推注，1天3次；治疗组造模成功后连续7天予以乌司他丁注射液1.7万U/kg（相当于成人用药量3倍剂量）加入2mL生理盐水中，静脉推注，1天3次。

2.4 观察指标及方法 于造模后第1、3、5、7天，分别为各组动物采集动脉血，离心后收集血清，严格按照试剂盒说明书采用ELISA法检测血清MMP-9、Caspase-3水平。

2.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计分析，数据用表示，采用单因素方差分析及t检验法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 两组血清基质金属蛋白酶-9水平比较 与模型组比较，治疗第1天治疗组MMP-9略低，但两组无统计学差异（P＞0.05）；治疗第3、5、7天，治疗组MMP-9水平均下降，与同时段模型组比较，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

3.2 两组血清半胱天冬氨酸蛋白酶-3水平比较

与模型组相比，治疗第1天治疗组Caspase-3略上升，但无统计学差异（P＞0.05）；治疗第3、5、7天，治疗组Caspase-3水平下降，与同时段模型组比较，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 两组血清Caspase-3水平比较（μmol/mL，±s）

表2 两组血清Caspase-3水平比较（μmol/mL，±s）

注：与模型组比较，△P＜0.05

模型组治疗组10 10 58.01±6.28 58.11±5.07 76.58±13.05 58.00±4.99△68.25±11.71 49.05±9.30△66.09±10.55 48.22±10.28△

3 讨论

近年研究表明，基质金属蛋白酶（MMPs）对神经系统的作用和影响十分广泛。MMPs是一组降解细胞外基质蛋白（extracellular matrix，ECM）的锌依赖蛋白酶，正常状态下以酶原形式存在，且被控制在较低水平，在某些病理生理情况下，其活性明显增加，参与组织的损伤与修复。Gao等[4]发现,脑缺血及再灌注后出现MMPs增加，而Yang等[5]发现在此过程中MMP-9增加最明显。MMP-9通过降解基底膜的ECM破坏血脑屏障，导致脑损伤，同时还通过诱导神经细胞变性死亡等机制造成脑损害。研究发现，脑出血（CH）后MMP-9水平变化与CH患者脑水肿的演变规律相一致[6]。CH能诱导内源性的MMP-9在脑组织中表达，破坏血脑屏障，使得循环中的大、小分子包括血浆蛋白、多种毒性物质、代谢产物及炎性细胞等进入脑内，进一步促进血管源性脑水肿的形成[7]。给予外源性MMP抑制剂,可在一定程度上减轻缺血和再灌注损伤,缓解继发于脑出血时的血管源性脑水肿[8]。

乌司他丁具有稳定溶酶体膜，减少炎症因子（IL-8、IL-6、TNF-α等）释放，抑制炎症反应的作用[9]。在对重症急性胰腺炎相关性脑损伤的实验研究中证实有较好的脑保护作用[10]。本实验结果显示，兔脑出血后，MMP-9明显升高，应用UTI治疗第3天后MMP-9明显下降，至第7天，降至接近正常水平，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。实验中UTI可能通过抑制溶酶体酶，稳定细胞膜和溶酶体膜的作用，保护ECM，抑制了MMP-9对ECM的破坏作用，从而维持血脑屏障的完整。因而，UTI可能通过上述途径起到脑保护作用。

脑损伤后细胞凋亡过程中最终都会激活细胞的半胱天冬氨酸蛋白酶。Jiang等[11]发现UTI能抑制失血性休克大鼠回肠组织Caspase-3蛋白的表达，抑制组织细胞凋亡，产生细胞保护作用。对CH大鼠脑片进行TUNEL染色的研究[12]发现，TUNEL染色阳性凋亡细胞在CH后6h开始出现，1～3天大量形成，3天达高峰，推测凋亡的内皮细胞可能促进血脑屏障破坏和血管神经源性水肿。吴倩佳等[13]研究显示，UTI可明显降低脑缺血再灌注中脑组织Caspase-3蛋白的表达，减少脑细胞凋亡。近年研究表明，在脑缺血再灌注损伤的过程中Caspase-3蛋白参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程，并起着重要的作用[14]。UTI可能使细胞线粒体破坏程度减轻，从而减慢凋亡进程，及早应用可以有效保护脑细胞。本实验结果显示，兔脑出血后应用UTI，血清Caspase-3下降明显，并与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示UTI可能抑制Caspase-3的激活，减少出血灶周围神经细胞的凋亡，产生脑保护作用。

综上所述，乌司他丁可下调脑出血模型兔动脉血MMP-9及Caspase-3含量，可减轻血管源性脑水肿，维持血脑屏障完整，减少细胞凋亡，对脑出血具有一定的脑保护作用。乌司他丁对脑出血后脑细胞保护的作用机制尚需进一步研究。

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（收稿：2015-01-15 修回：2015-01-27）

Effect of Ulinastatin on M atrix M etallopeptidase 9 and Caspase-3 in Rabbits w ith Cerebral Hemorrhage

TONG Liyan1,HU Caibao2,XU li3,FENG Weimin1. 1Department of Neurology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou (310007),China;2Department of Cardiology,Zhejiang Hospital,Hangzhou(310000), China;3ICU Ward&Department of Cardiology,First People's Hospital of Yuhang District,Hangzhou,Hangzhou (310000),China

Objective To investigate the effect of ulinastatin（UTI）on matrix metallopeptidase 9（MMP-9）and caspase-3 in cerebral hemorrhage model of rabbits,in an attempt to explore the neuroprotective effect of UTI. M ethods Twenty New Zealand rabbits with cerebral hemorrhage were randomly divided into 2 groups:model group and UTI group,with 10 rabbits in each group.Model group was given intravenous normal saline（2mL,b.i.d）and UTI group received intravenous injection of UTI（17000U/kg,b.i.d）for 7d.Blood samples were obtained to measure the contents of MMP-9 and caspase-3 with ELISA on Day 1,3,5,and 7.Results Compared with model group,the contents of MMP-9（951.72±216.35ng/L）and caspase-3（58.11±5.07μmol/mL）in UTI group on Day 1 were not significantly different（P＞0.05）,while those on Day3,5,and 7 were decreased significantly（MMP-9: 887.02±205.77ng/L,892.79±123.94ng/L,858.90±97.37ng/L;caspase-3:58.00±4.99μmol/mL,49.05±9.30μmol/mL, 48.22±10.28μmol/mL;all P＜0.05）.Conclusion UTI can reduce the contents of MMP-9 and caspase-3 during cerebral hemorrhage in model rabbits,indicating that UTI has cerebral protective effect on cerebral hemorrhage.

rabbits;cerebral hemorrhage;ulinastatin;matrix metallopeptidase 9;caspase-3

天普科学研究基金资助项目（No.01200919）；浙江省科技厅重症医学科技创新团队项目（No.2011R50018-02）

1杭州市中医院神经内科（杭州 310007）；2浙江医院心内科（杭州 310000）；3杭州市余杭区第一人民医院ICU重症监护室（杭州 311100）

胡才宝，Tel：13958169315；E-mail：zjicu1996@163.com