HBx基因转染对人肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响

史光军，类成刚，陈增银

(1青岛市市立医院，山东青岛266001;2青岛市城阳人民医院)

HBx由HBV基因组编码，具有多种调控功能，能激活多个与肿瘤侵袭相关的原癌基因及转录因子，是肝细胞癌发病的独立危险因素［1～3］。2008年3月～2013年3月，我们利用脂质体转染法转染人肝癌细胞系HepG2细胞，并用流式细胞仪、荧光显微镜观察细胞增殖情况，探讨HBx基因与肝癌细胞增殖的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 肝癌细胞株HepG2细胞(购自中科院上海细胞库)、脂质体(购自长沙赢润生物科技有限公司)、Annexin V-FITC(购自美国GeneCopoeia中国分公司)、SP试剂盒(购自福州迈新生物科技有限公司)、2%戊二醛(中国医药集团上海化学试剂公司)，寡核苷酸引物根据HBx基因的序列自行设计引物(由长沙赢润生物公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 重组X质粒转染HepG2细胞 HepG2细胞生长于含10%胎牛血清的MEM中，以脂质体转染的方法分别将重组X质粒、未重组X质粒转染入HepG2细胞中，命名为转染HBx细胞组、转染空载体细胞组，另设未转染HepG2细胞组，每组8例。具体步骤如下:选取对数生长期HepG2细胞，胰酶消化接种于直径25 cm培养瓶，细胞数为1×106/L，6 h后细胞即可贴壁，继而进行转染。37℃预热的无血清培养基加入 DNA 5 μg、Trans Fast Reagent 15 μL，立即涡旋混匀，室温下静置10～15 min。小心移出培养细胞的培养基，稍涡旋混匀脂质体/DNA混合物，轻轻加入培养瓶中，37℃孵育24 h，轻轻加入含血清的培养基(完全培养基)4 mL，不必移去脂质体/DNA混合物，37℃继续孵育48 h。

1.2.2 流式细胞仪检测HepG2细胞增殖活性 ①悬浮细胞离心(2 000 r/min离心5 min)，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集。②用PBS洗涤细胞2次，调整待测细胞的浓度为5×105～1×106/mL;取1 mL细胞，1 000 r/min 4℃离心10 min，弃上清。③加入1 mL冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，1 000 r/min 4℃离心10 min，弃上清，重复步骤2次。④加入500 μL的 Binding Buffer悬浮细胞。⑤加入5 μL Annexin V-FITC 混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀;避光室温反应15 min或4℃反应30 min。⑥室温、避光反应5～15 min。⑦加入300 μL Binding Buffer，在 1 h 内上机检测。50 mL PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)过滤，4℃避光保存备用。分别将转染HBx细胞组、转染空载体细胞组、未转染HepG2细胞组细胞用含10%胎牛血清的MEM稀释成1×104/mL，接种于6孔培养板。待细胞完全贴壁后，换为不含胎牛血清的MEM，继续培养24 h:每孔加入 Annexin V-FITC 50 μL(5 mg/mL)，继续培养4 h。小心吸掉培养孔内的上清液，每孔加入75 μL DMSO，振荡10 min，至结晶充分溶解。在492 nm波长下测定各孔的A值，代表各孔细胞增殖情况。

1.2.3 荧光显微镜观察各组细胞增殖比率 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡，其步骤为:①将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组;②用PBS洗涤细胞两次;③在500 μL 的 Binding Buffer中加入 2 μL Annexin VFITC、5 μL Propidium Iodide，混匀;④将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖;⑤避光、室温反应5 min。将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下滤光片观察Annexin V-FITC荧光信号。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量数据用±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析。计数资料以百分比表示，数据比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞一般情况 转染HBx细胞组的HepG2细胞在37℃孵育72 h，生长较其他两组的肝癌细胞密集。转染空载体细胞组和未转染HepG2细胞组的细胞未见异常增殖。PCR扩增结果提示，转染HBx的HepG2细胞组中有X基因表达，表达的灰度值为0.926±0.105;而空载转染组和未转染HepG2细胞组中均未见有X基因的表达;三组间比较有统计学差异(P＜0.05))

2.2 各组流式细胞仪增殖分析及荧光显微镜图像观察情况 流式细胞仪增殖分析显示，转染HBx细胞组的HepG2细胞较多处于增殖期(G2期细胞占5.68%)(见图1)。荧光显微镜图像显示，转染HBx细胞组的HepG2细胞于37℃孵育72 h处于增殖期的细胞比率为47%，转染空载体细胞组处于增殖期的细胞比率为28%，未转染HepG2细胞组处于增殖期的细胞比率为25%。转染HBx细胞组处于增殖期的细胞比率与其他两组比较有统计学差异(P均＜0.05)。见图2。

图1 转染HBx细胞组HepG2细胞流式增殖情况

图2 荧光显微镜下各组细胞增殖比率

3 讨论

HBV慢性感染是世界范围内原发性肝细胞癌(HCC)的主要发病原因之一，HBx基因致HCC发生的机制是目前研究的热点。HBx基因存在于HBV基因的第4个阅读框，为第1374～1838位核苷酸，长约465 bp。HBx基因在HBV中高度保守，其编码的HBx蛋白分子量约为17 kD，具有强大的生物学功能，包括反式激活病毒基因组和宿主细胞基因的转录、增强转录因子DNA结合特性、抑制p53蛋白活性、抑制细胞DNA的修复、参与细胞信号传导途径和细胞凋亡的调节等。这些功能可能与HCC 的发生具有密切的关系［4，5］。Zhu 等［6］检测 30例HCC患者，证实了HCC组织中存在HBx蛋白的表达;杨盛力等［7］对21例HCC采用免疫组化方法进行检测，发现肝癌细胞组织中HBx呈弥漫性表达。一些体内及体外研究也发现HBx可诱导细胞的恶性转化甚至参与癌变发生［8，9］。因此，观察HBx对体外细胞增殖的影响，可为进一步研究HBx致HCC的发生机制提供依据和线索。

本实验以脂质体转染的方法成功将X基因转染入HepG2细胞，并与转染空载体细胞组和未转染HepG2细胞组进行对照。发现转染HBx细胞组较其他两组的肝癌细胞密集，而转染空载体细胞组和未转染HepG2细胞组的细胞未见异常增殖。PCR扩增结果提示转染HBx的HepG2细胞组中有X基因的表达，而空载转染组和未转染HepG2细胞组中均未见有X基因的表达。说明HBx具有促细胞增殖作用，可能参与肝细胞恶性转化并促进其增殖。进一步用流式细胞仪分别检测三组细胞增殖情况，结果发现，转染HBx细胞组的HepG2细胞较多处于增殖期。荧光显微镜图像显示转染HBx细胞组的HepG2细胞处于增殖期的比率较其他两组明显升高。

HBx生物学效应十分复杂，有学者认为HBx主要通过反式激活机制调节细胞的增殖凋亡，参与调控细胞周期和细胞信号转导途径促进肿瘤发生［10］。随着人们对HBxAg研究的不断深入，发现X基因是高度保守的序列，但HCC却常伴有X基因突变，HCC与HBx基因的持续表达有密切关系。突变发生于缺乏核酸错配校正能力的病毒复制期或HBV整合和重排过程，突变X基因产生变异HBx。目前已能够用一种显色方法检测突变HBx的转活化功能，其转活化能力升高或降低因突变类型而异。自然发生的X基因突变经历肿瘤细胞选择，通过改变HBx的生物学功能，尤其是丧失诱导凋亡能力使肝细胞长期存活，在其他致癌因素作用下发生癌变［11，12］。X基因插入宿主DNA活化原癌基因或灭活抑癌基因中，是HCC启动和演进的主要原因之一。X基因整合对人HCC发生的作用可能略有不同。约90%HBsAg阳性的HCC患者整合有HBV基因，整合部位多在DR1、DR2及两者之间的黏性末端，因此 X基因大多保留且伴 3＇端截短。在mRNA检测中发现，HCC选择性表达X基因，而不表达S、C基因。推测细胞恶性转化是由于X基因及其增强子促进下游EGFR基因转录活化高表达所致。Diamantis等［13］采用RT-PCR方法检测了48例HCC组织中HBV基因在RNA水平的表达情况。其中，HBs基因表达者检出2例，HBc基因检出7例，而HBx基因检出40例。从RNA和蛋白质两个水平上都有证据说明HBx基因的表达与HCC的发生有密切关系。

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