北京地区对卷曲霉素和阿米卡星耐药结核分枝杆菌的rrs和tlyA基因突变研究

孙勇 邢青 张治国 易俊莉 王甦民 李传友



·论著·

北京地区对卷曲霉素和阿米卡星耐药结核分枝杆菌的rrs和tlyA基因突变研究

孙勇 邢青 张治国 易俊莉 王甦民 李传友

目的 探讨北京地区结核分枝杆菌卷曲霉素(Cm)和阿米卡星(Am)耐药与rrs基因和tlyA基因突变相关性。方法 采用比例法对保存的临床菌株进行Cm和Am药敏试验测定，并对其中的临床菌株rrs基因和tlyA基因进行PCR、测序分析。筛选得到了10株Am耐药菌株、25株Cm耐药菌株、15株Am和Cm交叉耐药菌株，并选择了30株敏感菌株作为对照分析。数据采用SPSS 17.0进行统计分析，组间率的比较采用Fisher精确概率法检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果tlyA基因突变结果显示，Cm耐药菌株有6株突变(24.0%，6/25)，与敏感菌株相比差异有统计学意义(P<0.05)，Am耐药菌株、Am和Cm交叉耐药菌株与敏感菌株相比差异无统计学意义(P>0.05)；在rrs基因检测中，Am耐药、Cm耐药、Am和Cm交叉耐药突变率分别有30.0%(3/10)、8.0%(2/25)和26.7%(4/15)，敏感菌株中也有10.0%(3/30)突变株，3组耐药菌株与敏感菌株比较，差异均无统计学意义(F=2.353、0.06、1.161，P值均>0.05)。在3组中，rrs基因A1401G突变位点突变比例分别是10.0%(1/10)、8.0%(2/25)和13.3%(2/15)，1株在Am和Cm交叉耐药双位点突变，共计6株A1401G位点突变菌株，与敏感菌株比较无统计学意义(P>0.05)。另一突变位点C1402T在Am、Am和Cm交叉耐药中各1株。结论 结核分枝杆菌tlyA基因可能与Cm耐药相关，与Am耐药不相关；rrs基因A1401G和C1402T突变可能与Am和Cm交叉耐药有关。

结核分枝杆菌； 卷曲霉素； 丁胺卡那霉素； 细菌蛋白质类; 突变； 北京市

目前，结核病仍是最常见的传染病之一，2013年WHO全球结核病报告发现仅2012年新增860万结核病患者，130万例死于结核病，同时3.6%的新发患者和20%的复治患者为MDR-TB[1]，中国5.7%的新发患者是MDR-TB，远高于世界的平均水平[2]。由于大量对一线抗结核药物耐药的菌株出现，特别是MDR-TB的蔓延，使得结核病无法得到有效的控制和治疗，所以开始联合应用一些二线抗结核药物，阿米卡星(amikacin，Am)和卷曲霉素(capreomycin，Cm)是其中的两种主要的抗结核药物。相比较一线抗结核药耐药分子机制的研究，这两种抗结核药的耐药研究相对较少，分子机制不是十分清楚。

本研究调查了北京地区Cm和Am耐药和敏感菌株rrs和tlyA基因分子特点，为了解本地区耐药的分子特点，进一步分析了本地区Cm和Am是否存在交叉耐药现象，为耐药结核病的快速诊断和治疗提供依据。

材料和方法

一、 材料

(一)菌种来源

菌株由北京结核病控制研究所提供，来自2008年1月至2010年12月北京丰台区、西城区、密云县、宣武区、崇文区、昌平区、怀柔区、顺义区、东城区、房山区、大兴区、通州区、石景山区、北京老年医院、延庆县、平谷区及北京结核病控制研究所等结核病防治机构就医的患者，患者痰液经改良罗氏培养，结核分枝杆菌培养阳性，确诊为肺结核，共计1480份，其中男性1101例，女性379例，年龄13～92岁，平均年龄39.1岁，菌株-80 ℃冻存。菌株根据《结核病诊断实验室检验规程》，采用对硝基苯甲酸、噻吩二羧酸肼生长实验进行菌种鉴定，采用比例法进行药敏试验测定[3]，Am和Cm临界浓度分别是40 μg/ml和40 μg/ml。

(二)主要仪器设备:

Bio-rad S1000基因扩增仪(美国Bio-Rad公司)，FoToDYNE凝胶成像系统(美国Image公司)，Nanodrop2000核酸分析仪(美国Thermo公司)，ESCO Ⅱ生物安全柜(新加坡ESCO公司)。

二、方法

(一)菌株复苏培养

采用改良罗氏培养复苏培养菌株、比例法做Am和Cm的药物敏感性试验。

(二) 基因组提取

采用酚/氯仿抽提的方法提取结核分枝杆菌基因组[4]。

(三)基因扩增

本研究利用primer premier 5.0探针对rrs基因和tlyA基因的全序列设计引物，引物序列及退火温度详见表1。PCR扩增采用50 μl体系、PFU DNA聚合酶(北京Generay公司)。

(四)PCR纯化

PCR产物经1%琼脂糖凝胶中电泳，用DNA凝胶回收试剂盒(杭州Axygen公司)回收DNA扩增片断，分别送北京擎科新业和北京金唯智生物科技公司测序。H37Rv的标准序列来自结核数据库网站[5]，用DNAMAN Version 5.2.2软件进行序列比对。

表1 结核分枝杆菌rrs和tlyA基因扩增引物

三、统计分析

数据采用SPSS 17.0进行统计分析，组间率的比较采用Fisher精确概率法检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 药敏试验结果

共计收集1480株菌株，经比例法测定药敏试验结果，Am耐药菌株11株(0.7%，11/1480)、Cm耐药菌株28株(1.9%，28/1480)，Am和Cm交叉耐药菌株19株(1.3%，19/1480)，Am和Cm均敏感菌株共1422株(95.6%，1415/1480)。

二、 基因组提取、PCR扩增结果

58株耐药菌株和随机选取30株Am和Cm均敏感菌株做为对照菌株进行抽提基因组，并对tlyA基因和rrs基因经特异性引物PCR扩增，由于抽提基因组或PCR的原因，成功扩增到10株Am耐药菌株，25株Cm耐药菌株、15株Am和Cm交叉耐药菌株的tlyA和rrs基因，得到相应片断的DNA条带，经凝胶回收对PCR产物进行纯化，公司测序比对后证实即为tlyA基因和rrs基因片断。

三、 基因突变结果

本研究共收集到50株Am和Cm耐药菌株，其中10株Am耐药菌株、25株Cm耐药菌株及15株Am和Cm交叉耐药菌株，此外还有30株Am和Cm均敏感的菌株。从表格2结果显示，Am耐药菌株和敏感菌株中均未发现tlyA基因突变株；Cm耐药菌株有6株突变24.0%(6/25)，包括E59K、F185C、L160终止子各1株、1株插入突变(683位点插入A)、1株缺失突变(534位点缺失T)和1株联合突变(471插入T，K182N，Q184L)，敏感菌株中无突变发生，耐药菌株与敏感菌株差异有统计学意义(F=4.603，P<0.05)；Am和Cm交叉耐药菌株中发现1株(6.7%,1/15)tlyA基因同义突变(V225V)；Am耐药菌株，Am和Cm交叉耐药菌株的tlyA基因耐药菌株与敏感菌株比较，差异均无统计学意义(F=0、2.045，P值均>0.05)。

在rrs基因检测中，发现Am耐药、Cm耐药、Am和Cm交叉耐药分别有30.0%(3/10)、8.0%(2/25)、26.7%(4/15)突变，敏感菌株中也有10.0%(3/30)突变株，3种耐药菌株与敏感菌株比较，差异均无统计学意义(F=2.353、0.06、1.161，P值均>0.05)。从突变类型上A1401G最多，在3种耐药组中分别有10.0%(1/10)、8.0%(2/25)、13.3%(2/15)，此外还有1株在Am和Cm交叉耐药双位点突变，共计6株A1401G位点突变菌株，与敏感菌株比较，差异无统计学意义(F=1.764，P>0.05)：A1401G和A513C，此双位点突变同样出现在敏感菌株中。同时A513C在Am耐药中有1株，2株在敏感菌株中。另一突变位点C1402T在Am、Am和Cm交叉耐药中各1株(表2)。

表2 tlyA、rrs基因突变在对Am和Cm耐药与敏感菌株中的分布

注a：与敏感菌株数量相比较，F=0、2.045，P>0.05；b：与敏感菌株数量相比较，F=4.603，P<0.05；c：为广泛性耐药菌株；d：与敏感菌株数量相比较，F=2.353、0.06、1.161，P>0.05

讨 论

目前Am和Cm属于二线抗结核药物，应用的不是很广泛，耐药比例相对较低，如本研究1480株菌株，Am、Cm及Am和Cm交叉耐药菌株3组比例分别约占到0.7%、1.9%、1.3%。耐药比例低，也显示了其抗结核的广泛应用前景，但国内外针对Am和Cm耐药的专项研究相对较少，对本地区的Am和Cm耐药分子特点和耐药机制进行研究，从而可以有效的应用Am和Cm二线抗结核药物，预防XDR-TB的发生。

Cm是属于多肽类抗生素，其结构和紫霉素相似，疗效似链霉素，但对耐链霉素的患者仍有效，对空洞性肺结核尤为显著。其作用主要通过绑定23S和16S核糖体(rrs)干扰结核分枝杆菌的核糖体翻译抑制细菌的生长，rrs基因的突变导致Cm药物作用靶点的改变，药物失去作用，从而产生耐药[6-9]。目前研究rrs基因A1401G的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点是Cm耐药主要的突变位点[10-12]。Am属于氨基糖苷类抗生素，和Cm一样是治疗MDR-TB的重要抗结核药物。目前研究认为Am耐药主要与rrs和tlyA基因突变相关，但其突变位点复杂[9,13]。多数研究认为Cm和Am存在交叉耐药的关系[12,14]。

一、tlyA基因与Am和Cm耐药相关性分析

Maus等[15]通过体外诱导tlyA基因的SNP位点为野生型，恢复了耐药菌株对Cm的敏感度，验证了tlyA基因突变导致Cm耐药的发生。研究认为tlyA蛋白和核糖体甲基转移酶具有同源性，它通过调节细菌核糖体的甲基化，达到杀菌作用，而tlyA基因的突变使得核糖体缺少了甲基化，导致耐药的产生[16]，但tlyA基因突变位点较复杂，而且临床菌株中突变率相对较低[11]。Engström等[17]在研究中发现55株Cm耐药菌株中仅有2株发现了tlyA基因突变(N236K)，而且敏感菌株中也发现了2株发生了突变(A5V和A29V)，因此他们得出结论tlyA基因的突变不会导致Cm耐药，tlyA基因并不是一个敏感的Cm耐药检测指标。Jugheli等[12]更是在145株Am、Cm和Km耐药菌株中未发现tlyA基因突变，这和我们的结论正好相反，本研究测序发现50株临床耐药菌株中，有7株菌株发生了tlyA基因突变，其中6株在Cm耐药菌株中，在Am和Cm交叉耐药菌株中有1株同义突变，30株敏感菌株中未发现突变，提示tlyA基因可能与Cm耐药相关，同时在Am耐药菌株中也未找到tlyA基因突变，因此其可能与Cm和Am交叉耐药不相关。

二、其他地区tlyA基因与Am和Cm耐药相关性分析

目前tlyA基因研究相对较少，因此我们总结了分析其他地区Am和Cm与tlyA基因突变相关性的研究(表3)，分析其他地区耐药分子特点及地区差异性。从表 3中发现各地区tlyA基因突变率较低(<8%)，而且基本相互之间没有相同的突变位点，突变率略低于本研究比例(12.1%，7/58).tlyA基因不如rpoB基因和利福平耐药相关性强(突变率约90%)[18]，这可能也是tlyA基因不被一些专家认可的重要原因。Georghiou等[13]也回顾性分析了全球8个tlyA基因与Am、Cm和Km耐药相关性的研究，他们发现在全部366株Cm耐药菌株中，tlyA基因突变率较低，仅占到了1%～3%，但在559株敏感菌株中未发生突变，因此他们认为tlyA基因突变是一个高特异度的Cm耐药鉴定指标。这种相互矛盾结果的产生可能和地区差异或tlyA基因自身的突变特点有关，各地区主要流行的结核分枝杆菌类型不同所造成基因突变的位点也不尽相同；另外，tlyA基因突变率较低和它突变的多态性也可导致研究之间差异不同，所以尽管在Cm耐药菌株中tlyA基因敏感度较低，但它有很强的特异度，因此结合Georghiou[13]等的研究结果，我们认为tlyA基因突变仍是诊断Cm耐药的指标之一。

三、rrs基因与Am和Cm耐药相关性分析

此前已有学者认为rrs基因A1401G突变是检测Am耐药较好的诊断价值，特异度100%，敏感度也达到了94.2%[12]；笔者总结了全球各地的Am和Cm与rrs基因突变相关性的研究，如表3所示，rrs基因突变率明显高于tlyA基因，其中仅A1401G位点突变率达到了50%～90%。尽管我们针对的rrs基因全序列完成了测序，但研究发现rrs基因突变主要集中在A1401G、C1402T和A513C三个位点，突变率15.5%(9/58)，远低于其他研究的比例，这可能与本研究耐药菌株较少有关。我们发现A1401G单突变在Am、Cm、Am和Cm交叉耐药菌株三组中均有出现，敏感菌株中并未发现，其中2株Am和Cm交叉耐药菌株中1例为XDR-TB，提示我们A1401G突变可能与交叉耐药相关。Manus等[14]和Du等[10]的研究证实了A1401G的突变位点不仅和3种抗结核药物高水平耐药相关，而且也是它们交叉耐药的位点。本研究中，C1402T在Am、

表3 对Am和Cm耐药的结核分枝杆菌在不同国家和地区的tlyA基因和rrs基因突变分子特点

注 NO：表示没有数据；小括号内数字表示：(突变数/耐药菌株数，突变率)

Am和Cm交叉耐药菌株中各有1株，2株耐药菌株均为XDR-TB菌株，如果C1402T是XDR-TB的特异性突变位点，那可以快速方便的鉴定XDR-TB，大大节约了时间和费用，但其他研究并没涉及这一方面，进一步验证还需要扩大样本进行研究；本研究中并未发现G1484T突变位点。Maus等[14]研究也认为C1402T和G1484T位点也与Am和Cm交叉耐药相关。Khanna等[20]在XDR-TB的耐药基因的检测中，发现了A1401G和G1484T和Am、Cm和Km的相关性。Manus等[14]研究认为A1401G、C1402T和G1484T三个突变位点中，每一个突变位点都是独立的交叉耐药位点。Georghiou等[12]回顾性分析了22个相关研究发现，在400个耐药菌株中，C1402T和G1484T位点突变率比较低，均不到1%，同时在Cm敏感菌株中，有7%的A1401G位点突变，因此他们得出结论是A1401G可以诊断Am和Km耐药，但不是判断Cm耐药的特异性指标。本研究中还发现A513C突变位点有2株在耐药菌中，其在Am和Cm交叉耐药菌株有1株，但在敏感菌株中也有3株发生突变，因此其是否与耐药或交叉耐药相关需要进一步研究。

四、Am和Cm耐药分子特点研究的临床意义

鉴定交叉耐药可以有效指导临床用药，如果患者对于Cm耐药，那么就可以认为Am也存在耐药不再应用，而使用其他抗结核药物，提高了治疗效果和效率；如果患者对于Am和Cm都敏感，那么就可以使用便宜的Am，减轻了患者的负担。由于Am 和Cm等药物耐药导致XDR-TB的发生，Perdigo等[21]检测到MDR-TB菌株中30.8%的rrs基因A1401G 和 42.3%的tlyA基因 Ins755GT突变，因此研究tlyA、rrs基因突变对于广泛性耐药结核分枝杆菌的分子特点研究和临床用药有指导意义。

五、目前研究现状及本研究不足之处

由于各地区tlyA基因突变率较低和rrs基因突变的差异，还有70%～80%耐药菌株无法解释耐药机制[13]，因此学者也对其他基因进行了研究，认为eispromoter和gidB等基因可能和Am、Cm耐药相关[11,13,17]。此外，Kumar等[22]研究认为Rv1876和Rv3224基因可能和结核分枝杆菌的铁离子的调节和代谢相关，从而导致其对二线药物Km和Am的耐药。目前，尽管这些研究的耐药突变比例较低，但却拓展了其耐药分子机制的研究，增加了Am和Cm耐药诊断的敏感度和特异度，为将来快速诊断的研究提供了依据。

总之，我们的结果表明tlyA基因可能与Cm耐药相关，与Am耐药不相关，在rrs基因A1401G和C1402T位点可能与Am和Cm交叉耐药有关。由于tlyA基因和rrs基因突变比例较低，因本研究从北京地区3年的部分临床株仅筛选到50株耐药菌株，有一定局限性。但也说明了Cm和Am耐药率较低，有较强的临床应用前景。所以需进一步扩大样本，同时针对其他耐药机制，如细胞膜的通透性、外排泵或其他耐药基因等进行进一步的研究。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis control: WHO report 2012. Geneva: World Health Organization， 2012.

[2] Zhao Y, Xu S,Wang L, et al. National survey of drug-resis-tant tuberculosis in China. N Engl J Med, 2012, 366(23):2161-2170.

[3] 中国防痨协会基础专业委员会. 结核病诊断实验室检验规程. 北京:中国教育文化出版社, 2006：33-37;49-51.

[4] Parish T，Stoker NG.Mycobacteriumtuberculosisprotocols. Totowa NJ: Humana Press, 2001:19-30.

[5] Reddy TB, Riley R, Wymore F, et al.TB database: an integrated platform for tuberculosis research. Nucleic Acids Res，2009,37：D499-508.

[6] Ambergenov R, ShcherbAmov D, Matt T, et al. Molecular basis for the selectivity of antituberculosis compounds capreomycin and viomycin. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(10):4712-4717.

[7] Taniguchi H, Chang B, Abe C, et al. Molecular analysis of kanamycin and viomycin resistance in Mycobacterium smegmatis by use of the conjugation system. J Bacteriol, 1997, 179(15):4795-4801.

[8] Zhang H, Li D, Zhao L, et al. Genome sequencing of 161Mycobacteriumtuberculosisisolates from China identifies genes and intergenic regions associated with drug resistance. Nat Genet, 2013, 45(10):1255-1260.

[9] Alangaden GJ, Kreiswirth BN, Aouad A, et al. Mechanism of resistance to amikacin and kanamycin inMycobacteriumtuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 1998, 42(5):1295-1297.

[10] Du Q, Dai G, Long Q, et al.MycobacteriumtuberculosisrrsA1401G mutation correlates with high-level resistance to kanamycin, amikacin, and capreomycin in clinical isolates from mainland China. Diagn Microbiol Infect Dis, 2013, 77(2):138-142.

[11] Sowajassatakul A, Prammananan T, Chaiprasert A,et al. Molecular characterization of amikacin, kanamycin and capreomycin resistance in M/XDR-TB strains isolated in Thailand. BMC Microbiol, 2014, 14:165.

[12] Jugheli L, Bzekalava N, de Rijk P, et al. High level of cross-resistance between kanamycin, amikacin, and capreomycin amongMycobacteriumtuberculosisisolates from Georgia and a close relation with mutations in therrsgene. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(12):5064-5068.

[13] Georghiou SB, Magana M, Garfein RS, et al. Evaluation of genetic mutations associated withMycobacteriumtuberculosisresistance to amikacin, kanamycin and capreomycin: a systematic review. PLoS One, 2012, 7(3):e33275

[14] Maus CE, Plikaytis BB, Shinnick TM. Molecular analysis of cross-resistance to capreomycin, kanamycin, amikacin, and viomycin inMycobacteriumtuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(8):3192-3197.

[15] Maus CE, Plikaytis BB, Shinnick TM. Mutation oftlyAconfers capreomycin resistance inMycobacteriumtuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(2):571-577.

[16] Feder M, Pas J, Wyrwicz LS,et al. Molecular phylogenetics of the RrmJ/fibrillarin superfamily of ribose 2′-O-methyltransferases. Gene, 2003, 302(1-2):129-138.

[17] Engström A, Perskvist N, Werngren J, et al. Comparison of clinical isolates and in vitro selected mutants reveals thattlyAis not a sensitive genetic marker for capreomycin resistance inMycobacteriumtuberculosis. J Antimicrob Chemother, 2011, 66(6):1247-1254.

[18] Cavusoglu C, Hilmioglu S, Guneri S, et al. Characterization ofrpoBmutations in rifampin-resistant clinical isolates ofMycobacteriumtuberculosisfrom Turkey by DNA sequencing and line probe assay. J Clin Microbiol, 2002, 40(12):4435-4438.

[19] Hu Y, Hoffner S, Wu L, et al. Prevalence and genetic characterization of second-line drug-resistant and extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisin Rural China. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(8):3857-3863.

[20] Khanna A, Raj VS, Tarai B, et al. Emergence and molecular characterization of extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from the Delhi Region in India. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(11):4789-4793.

[21] Perdigão J, Macedo R, Malaquias A, et al. Genetic analysis of extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisstrains in Lisbon, Portugal. J Antimicrob Chemother, 2010, 65(2):224-227.

[22] Kumar B, Sharma D, Sharma P, et al. Proteomic analysis ofMycobacteriumtuberculosisisolates resistant to kanamycin and amikacin. J Proteomics, 2013, 94:68-77.

(本文编辑：王然 薛爱华)

MycobacteriumtuberculosisrrsandtlyAgene of mutations correlates with resistance to capreomycin and amikacin from Beijing

SUNYong*,XINGQing,ZHANGZhi-guo,YIJun-li,WANGSu-min,LIChuan-you.

*ClinicalLaboratoryBeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

LIChuan-you,Email:lichuanyou6688@hotmail.com

Objective To explore theMycobacteriumtuberculosisofrrsandtlyAgenes mutations associated with capreomycin and amikacin resistance in Beijing. Methods The preservation of clinical strains were idenfitied capreomycin and amikacin susceptibility by proportion method, and were performed to identify clinical strains ofrrsandtlyAmutations by PCR and sequencing analysis. There were 10 cases of amikacin resistant strains, 25 cases of capreomycin resistant strains, 15 cases of amikacin and capreomycin cross resistant strains, and 30 cases of sensitive strains were as the contrast analysis. SPSS 17.0 is used for data statistical analysis, group rate is compared with the Fisher exact probability test,P<0.05 is considered statistically significant difference. Results The results oftlyAgene mutations showed that six mutant strains (24%,6/25) had drug resistant strains of capreomycin, compared with the sensitive strain was statistically significant (P<0.05)，Am, Am and Cm cross resistance strains compared with susceptible strains had no statistical significance (P>0.05)；Am, Cm, Am and Cm cross resistance of mutations rate were respectively 30.0% (3/10), 30.0% (2/25), 26.7% (4/15) inrrsgene, sensitive strains of mutations rate was 10.0% (3/30), three groups of drug resistant strains and sensitive strains were not statistically significant difference (F=2.353、0.06、1.161，P>0.05).In three groups, the A1401G ofrrsgene mutations rate were respectively 10.0% (1/10), 8.0% (2/25), 13.3% (2/15), one strain was double mutations site in the Am and Cm cross resistance group, 6 strains were A1401G mutation strains, compared with the sensitive strain had no statistical significance (P>0.05). The C1402T ofrrsgene mutations had respectively one stains in the Am, Am and Cm cross resistance groups. Conclusion Mutations oftlyAgene may be associated with capreomycin resis-tance, and was not relevant to amikacin resistance; Mutations ofrrsgene A1401G and C1402T could be related to amikacin and capreomycin cross resistance inMycobacteriumtuberculosisstrains.

MycobacteriumtuberculosisCapreomycin； Amikacin； Bacterial poteins; Mutation； Beijing city

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.009

首都医学发展基金(2009-1055)；北京市医院管理局临床医学发展专项 (ZYLX201304)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院检验科(孙勇)，细菌免疫学研究室 耐药结核病研究北京市重点实验室(李传友)；北京结核病控制研究所检验科(邢青、易俊莉、王甦民)；北京市昌平区结核病防治所检验科(张治国)

李传友，Email:lichuanyou6688@hotmail.com

2015-03-19)