丙型肝炎患者抗黏病毒A基因的表达

潘宗玮 李 艳

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Ⅴirus，HCⅤ）是单股正链RNA病毒，宿主仅局限于人类和黑猩猩，可引起人类丙型病毒性肝炎，最后发展成为肝纤维化、肝硬化和肝癌［1，2］。据世界卫生组织统计，全球HCⅤ的感染率约为3%，其中80%的新发感染者不能清除病毒，发展为慢性持续性感染者［3］。目前发现，干扰素－α（Ⅰnterferon－α，ⅠFN）和利巴韦林联合治疗慢性HCⅤ感染者的总有效率仅为50%，而治疗急性HCⅤ感染者可以提高到90%［4］。因此及时发现急性HCⅤ感染者对疾病的治疗转归有重要的临床意义。

急性HCⅤ感染者在发病初期抗－HCⅤ抗体阳性检出率较低，3个月后才可达到90%以上，所以仅凭抗－HCⅤ抗体诊断急性HCⅤ感染存在一定的滞后性［4］，急需寻找新的标志物辅助急性 HCⅤ感染的诊断。抗黏病毒 A（Myxovirus Resistance A，MxA）蛋白与病毒的感染密切相关，极少的病毒量即可诱导细胞表达 MxA蛋白［5］。故此，本文通过观察丙肝患者体内MxA mRNA表达量的变化，旨在为临床诊断HCⅤ感染提供早期依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2013－03－2015－01在武汉大学人民医院感染科门诊及住院的急性丙型肝炎（Acute Hepatitis C，AHC）患者（AHC组），其中男34例，女37例，年龄48.5±13.8岁。纳入标准：未经治疗并且持续感染时间不超过6个月。排除标准：患有自身免疫系统疾病，合并有肾病、糖尿病以及其它感染性疾病等，以及经过治疗的HCⅤ感染者。78例慢性丙型肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）患者（CHC组），其中男40例，女38例，年龄49.0±15.1岁。以上疾病诊断均符合《丙型肝炎防治指南》［6］。另选69例体检健康者为对照组，其中男35例，女34例，年龄46.4±13.5岁。三组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。所有研究对象均签订知情同意书并通过伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂

人外周血RNA逆转录PCR分析仪购自ABⅠ公司（Ⅴeriti，美国）；MxA mRNA荧光定量分析仪购自ABⅠ公司（ⅤⅠⅠ7，美国）；HCⅤ RNA 荧光定量PCR仪购自 Roche公司（Light cycler 480ⅠⅠ，瑞士）。RNA提取试剂Trizol和荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex Taq ⅠⅠ购自 TaKaRa公司（中国大连），cDNA反转录试剂盒购自Thermo SCⅠENTⅠFⅠC公司（美国），HCⅤ RNA定量检测试剂盒购自凯杰公司（德国）。

1.3 标本采集

采用EDTA抗凝管采集外周静脉血2ml，用于检测HCⅤ RNA载量和MxA mRNA表达量。

1.4 总RNA提取和逆转录

按照淋巴细胞分裂液说明书提取外周血单个核细胞。Trizol法提取单个核细胞中的总RNA。取5μl RNA模板进行逆转录，加入1μl Oligo（dT）18引物混匀并瞬时离心，65℃5min，反应体系：4μl反应缓冲液，2μl镁离子，1μl逆转率酶，1μl RNA酶抑制剂，6μl ddH2O。反应条件：42℃ 60min，72℃10min，4℃保存。得到的cDNA产物放置在－20℃冰箱保存备用。

1.5 MxA mRNA相对表达量测定

采用荧光定量PCR法检测MxA mRNA的表达。扩增引物见表1。以人GAPDH基因作为内参对照，反应体系如下（总体积为20μl）：cDNA 1μl，引物lμl，SYBR Premix Ex Taq ⅠⅠ 10μl，ROX ⅠⅠ 0.4μl，ddH2O 7.6μl。扩增条件为95℃30s预变性；95℃20s，60℃20s，72℃35s，50个循环，溶解曲线条件：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。MxA 基因mRNA表达水平采用相对表达量表示，即ΔCt表示，ΔCt＝CtMxAmRNA－CtGAPDH。

表1 MxA mRNA和GAPDH引物序列

1.6 HCⅤ RNA载量的测定

采用 ⅤⅠⅠA7荧光定量 PCR 仪，按照 HCⅤRNA定量试剂盒的操作说明，检测HCⅤ RNA载量。HCⅤ RNA最低检测限为1×103ⅠU／ml。

1.7 统计学处理

用SPSS 19.0软件对数据进行分析，正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用方差分析，不同组间均数两两比较采用SNK检验，采用Pearson进行相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组MxA mRNA表达量的比较

AHC组、CHC组、对照组MxA mRNA相对表达量存在显著性差异（F＝987.57，P＜0.01）；AHC组、CHC组表达量均高于对照组（P＜0.05），CHC组MxA相对表达量高于AHC组（P＜0.05）。

2.2 各组间HCⅤ RNA载量比较

AHC组的 HCⅤ RNA载量（Log10HCⅤ＝4.37±0.85）较CHC组（Log10HCⅤ＝6.35±0.83）低，差异有统计学意义（t＝－14.36，P＜0.01）。

表2 各组MxA mRNA相对表达水平比较（±s）

表2 各组MxA mRNA相对表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与 AHC组比较，2）P＜0.05

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2.3 MxA mRNA表达量与HCⅤ RNA载量相关性分析

AHC组MxA mRNA表达量与HCⅤ RNA载量呈负相关（r＝－0.865，P＜0.001），而 CHC组MxA mRNA表达量与HCⅤ RNA载量无明显相关性（r＝0.174，P＞0.05）。

3 讨 论

HCⅤ通过多种机制逃避固有免疫和适应性免疫应答以维持其持续感染。比如，HCⅤ NS2蛋白也被发现能抑制ⅠFN－α，ⅠFN－β，白细胞介素－29（ⅠL－29）和趋化因子基因的启动子活性［7］。除此之外，HCⅤ NS3／4A蛋白酶通过切割β干扰素TⅠR结构域衔接蛋白（TRⅠF）和线粒体抗病毒信号蛋白（MA－ⅤS）［8］两者关键衔接分子，使核因子－κB（NK－κB）和干扰素调节因子3（ⅠRF3）不能激活，从而阻断Ⅰ型ⅠFN的生产。

人Mx基因位于第21号染色体长臂上，经Ⅰ型ⅠFN诱导产生MxA和MxB蛋白［9］。MxB蛋白目前未发现有抗病毒活性，而MxA蛋白具有广谱的抗病毒效应。MxA蛋白只有在与病毒的核糖核蛋白体中的核衣壳紧密结合后才能发生活化，活化的MxA发挥对病毒核衣壳的水解作用，阻止病毒对细胞的吸附与穿入，从而阻止病毒基因组在细胞核内复制［10］，水解后释放出来的RNA核酸很快被胞浆中的核酸内切酶降解。也有研究［11］表明dsRNA也可作为MxA基因表达的诱导剂。少量的病毒即可诱导Mx蛋白的表达，而细菌、寄生虫及其它微生物感染细胞并不能诱导Mx蛋白表达。因此，细胞中Mx蛋白表达水平的高低可以作为病毒感染的一个标志，用来与细菌等其它微生物的感染作鉴别诊断。

据报道，在 HCⅤ急性感染早期，机体存在HCⅤ RNA 阳 性 而 抗－HCⅤ 抗 体 阴 性 的 窗 口期［12，13］。在此窗口期，HCⅤ 核蛋白被浆细胞树突状细胞（PDC细胞）内化并抑制PDC细胞分泌ⅠFN，而当机体形成抗HCⅤ核蛋白抗体后，PDC可能已经在数量及功能上受到损伤［14］。这可能是宿主进入慢性持续感染的原因。慢性HCⅤ感染患者体内含有较高水平的核心蛋白（Core），其能增加非磷酸化的信号转导与转录激活因子1（STAT1）的表达从而降低PDC分泌ⅠFN。这可能与非磷酸化的STAT1与ⅠFN受体下游的JAK／STAT受体竞争性结合相关［15］。最后导致宿主抗病毒基因表达降低。故此，寻找能早期诊断HCⅤ感染阶段的灵敏指标对预防急性HCⅤ感染进入慢性感染具有重要临床意义，有利于提高HCⅤ感染的治疗有效率［4］。

本文结果显示，AHC组和CHC组MxA mRNA表达量较正常对照组高，且AHC患者MxA mRNA表达量与HCⅤ RNA载量呈正相关，表明机体感染HCⅤ后可通过调节固有免疫系统发挥抗HCⅤ效应，并且急性HCⅤ感染阶段（即AHC患者）随着病毒量的增多抗病毒基因表达增强，但随着HCⅤ机体免疫系统的破坏导致HCⅤ感染者进入慢性化阶段［14，15］。

综上所述，检测 MxA mRNA表达可为HCⅤ急性期的早期诊断和治疗提供有价值的辅助性依据。