Spn蛋白在结肠癌组织中表达的临床病理意义

黄 河，罗 恩

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其发生与多步骤基因突变及表型改变有关[1]。基因突变导致结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭与分化能力发生改变，引起结肠癌发生与发展。经典的信号通路Wnt/b-catenin、TGF-b/BMP、K-RAS、PI3K 等均与结肠癌发生有关[2]。尽管目前诊断技术进步，很多结肠癌可在早期诊断，但仍有大约1/3患者诊断时有转移，而复发率高达40%[3]。系统性化疗目前对结肠癌治疗取得一定效果，报道临床有效反应率在40%～60%[4]。但临床仍有一些患者对治疗无反应，因此，寻找新的有效治疗靶点具有重要的意义。

树突棘亲和素（spinophilin,Spn）是一种支架蛋白（scaffolding protein），定位于 17q21.33，这一基因区与细胞微卫星不稳及杂合性丢失密切相关。研究发现，位于 17q21 的 BRCA1，17q21.3 区基因缺失，与乳腺癌，前列腺癌及泌尿系肿瘤密切相关[5]。尽管目前研究报道Spn蛋白与头颈部癌[6]、肝癌[7]等恶性肿瘤发生有关，但在结肠癌组织中Spn蛋白表达情况及Spn蛋白的临床病理意义目前并未清楚，为此，本研究对Spn蛋白在结肠癌中表达情况作了深入的分析。

1 材料与方法

1.1 组织标本 收集2013年10月1日～2014年5月1日我院胃肠外科20例手术切除的结肠癌患者肿瘤组织、癌旁组织及距癌组织边缘＞5 cm的正常结肠组织，标本切除后，部分立即放入液氮，备RNA提取使用；部分采用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋，4 μm切片备免疫组化用。同时于我院病理科调取46例结肠癌组织石蜡块行免疫组化分析。所有患者术前未进行放、化疗等抗肿瘤治疗，所有标本均经术后病理确诊。本组46例结肠癌患者中，男36例，女 10 例，年龄 17～70（54.36±10.30）岁，中位年龄55岁。结肠癌的分期按照2010年第7版国际抗癌协会制定的TNM分期标准。

1.2 主要试剂 总RNA提取试剂盒购于百泰克生物科技有限公司，逆转录试剂盒及RT-qPCRSYBR GreenⅠ检测试剂盒购于TaKaRa公司，兔抗人Spn抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，免疫组化SP检测试剂盒及DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 RNA提取及RT-PCR 用Trizol从结肠癌组织和癌旁组织样本中提取总RNA，浓度及纯度用分光光度计检测，然后按照试剂盒说明将RNA反转录为cDNA。RT-PCR中Spn引物序列参考文献[8]，forward 5＇-GCCCAGCTAATTCAGCAGAC-3＇,reverse 5＇-GGAG CTCCTTGAACTTGTGC-3＇；及内参GAPDH引物序列为 ,5＇-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3＇（forward）,5＇-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3＇（reverse）。 每 个实验重复3次。取2 μg总RNA行RT-PCR，按试剂盒说明操作。 mRNA 相对表达量=2-△△Ct，△Ct=Ct目的基因-Ct内参，△△Ct=△Ct癌-△Ct癌旁。

1.4 免疫组化 按照免疫组化SP检测试剂盒说明书操作：结肠癌石蜡切片用二甲苯脱蜡，然后梯度酒精水化，用pH值为6的0.01 mol/L枸橼酸钠溶液在95℃抗原修复10 min，加入1∶100兔抗人Spn单克隆抗体4℃冰箱过夜，PBS洗3次，5 min/次；然后加入二抗室温作用30 min，DAB显色，苏木素复染，透明采用二甲苯溶液，封片用中性树胶。采用空白一抗作为阴性对照；用已知Spn蛋白表达阳性的乳腺癌切片作阳性对照。

[7]方法评估染色结果，采用染色百分比与染色强度相结合方法。染色百分比评分：0为没有细胞染色，1为1%～10%细胞染色，2为11%～50%细胞染色，3为51%～80%细胞染色，4为＞80%细胞染色；染色强度评分：0为阴性，1为弱阳性，2为中等，3为强阳性。染色百分比与染色强度评分结果相乘，总分为0～12分，总分≤6为阴性，＞6为阳性。病理阅片结果不一致时，由两位有经验的病理医师重新评估并协商确定。

1.5 Western blot 提取结肠癌与癌旁组织Spn蛋白，取50 μg蛋白做10%SDS-PAGE电泳，转膜采用聚二氟乙烯（PVDF）膜，采用5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST 洗膜 3 次，15 min/次，然后加入兔抗人 Spn（1∶100）及内参抗体 GAPDH （1∶1000），4 ℃摇床过夜。TBST 洗膜后加入相应 HRP 标记的二抗（1∶2000），室温孵育2 h，然后采用ECL化学发光试剂盒进行发光显影。

1.6 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量数据以x±s表示，比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌及癌旁组织中Spn表达情况 Q-PCR检测结果表明，20例结肠癌组织及癌旁组织中，Spn的mRNA仅在2例增高，增高率为10%；Spn的mRNA 在结肠癌组织相对表达量为 1.03±0.16，而在癌旁组织中相对表达量为 3.86±0.32。免疫组化检测结果提示，Spn蛋白主要定位于细胞浆或胞膜，呈淡黄至棕黄，团块或片状分布，癌组织中呈弱阳性或不着色。癌旁组织的Spn阳性率为90%（18/20），明显高于结肠癌组织的 43.5%（20/46）（图 1）。 Western blot显示结肠癌旁组织Spn蛋白明显高于结肠癌组织（图 2）。

图1 结肠癌旁组织及不同分化程度的结肠癌组织Spn表达（Envision×200）A：结肠癌旁组织Spn表达强阳性；B：高分化结肠癌组织中Spn表达较弱；C：低分化结肠癌组织Spn表达阴性

图2 Western blot检测结肠癌与癌旁组织Spn蛋白表达1：癌组织；2：癌旁组织

2.2 结肠癌组织中Spn低表达与临床病理特征关系 46例结肠癌组织标本中，Spn低表达20例。分析Spn蛋白表达与患者临床病理特征关系，发现Spn蛋白表达情况与患者性别、年龄无关，但与患者肿瘤分化程度（P=0.002）和浸润情况（P=0.024）及淋巴结转移情况（P=0.014）有关。尽管Spn蛋白表达与患者远处转移无统计学差异（P=0.141），但有转移患者70.6%Spn蛋白阴性表达，明显高于48.3%的无远处转移患者。见表1。

表1 Spn蛋白表达与结肠癌临床病理特征的关系

3 讨论

Spn定位于染色体17q21.33，目前研究发现这一区域含有较多的抑癌基因，包括BRCA1、NME1、prohibitin等，其突变被认为与恶性肿瘤发生有关[8]。目前17q21研究较多的是BRCA1，其突变在乳腺癌等恶性肿瘤中发挥重要作用。而最近研究发现，恶性肿瘤中Spn缺失可能在肿瘤发生中有重要的作用，在肺癌中报道Spn突变率高达53%[9]。但目前已知Spn可与多达30种蛋白相互作用，包括蛋白磷酸酶 1（protein phosphatase 1，PP1）及 F-actin。

其他的信号通路包括细胞骨架和细胞黏附分子、酶、G蛋白信号通路、膜受体、离子通路和肿瘤抑制蛋白ARF等。Spn也调节着跨膜蛋白，通过p70S6与细胞内的促有丝分裂的信号事件相关。Spn可导致pRb磷酸化，使pRb抑制肿瘤功能丧失有关，导致恶性肿瘤增殖。Spn可通过与PP1结合形成复合体，抑制PP1磷酸酶活性，通过干扰线粒体纺锤体，导致胶质瘤细胞死亡。本研究发现，结肠癌组织中Spn表达较癌旁明显减低，而且分化较差的结肠癌组织中Spn表达较分化高的Spn蛋白表达低，表明结肠癌中存在Spn缺失，而且Spn缺失与结肠癌恶性进展密切相关。

P53突变可能与Spn缺失导致恶性肿瘤进展密切相关，Spn缺失可促进肿瘤发展，Spn缺失同时合并P53缺失可明显促进肿瘤发展。在肺癌中，Spn缺失伴随着明显的P53突变。P53突变促进Spn缺失致肿瘤发生的机制可能与P53增殖抑制作用丧失，导致Spn缺失使恶性肿瘤细胞增殖密切相关。而结肠癌中P53突变率高达50%，P53突变导致肿瘤细胞化疗药物耐药，与P53调亡作用丧失有关，提示结肠癌中P53突变可能更加促进Spn缺失导致的结肠癌细胞增殖，促进结肠癌进展。

恶性肿瘤中Spn表达降低的机制除了碱基缺失及基因突变外，研究发现miRNA调控异常也是重要原因。目前发现miRNA-106a可靶向作用于Spn，恶性肿瘤中miRNA-106a与Spn存在相反的关系，miRNA-106a表达增高可促进Spn表达减低，促进恶性肿瘤发生、发展。

总之，本研究发现结肠癌中Spn表达较癌旁组织中低，而且低表达Spn与患者不良预后有关，表明Spn缺失可能在结肠癌恶性进展中发挥重要作用。通过调控Spn蛋白表达，可能对结肠癌的治疗有一定的价值。

【参考文献】

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[7]Aigelsreiter A,Ress AL,Bettermann K,et al.Low expression of the putative tumour suppressor spinophilin is associated with higher proliferative activity and poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma [J].Br J Cancer,2013,108（9）:1830-1837.

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