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复方王不留行片的质量标准研究

2015-05-21赵建颖卢晓梅李亮亮许明哲洛阳市食品药品检验所河南洛阳471023

中国药房 2015年24期
关键词:苯甲酸氨基黄酮

赵建颖,卢晓梅,李亮亮,许明哲(洛阳市食品药品检验所,河南 洛阳 471023)

复方王不留行片是由王不留行、邻氨基苯甲酸、干酵母、乳酸钙组成的复方制剂,具有增强体质、通经活血、散结、下乳、消肿、消痈的功效,临床上用于产后气血亏损、乳汁不通不下或乳少及乳痛、乳肿等症。国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第十四册WS-10001-(HD-1369)-2003未对方中主药王不留行进行质量控制,文献报道[1]仅见方中王不留行薄层色谱(TLC)鉴别方法,未见王不留行中王不留行黄酮苷的含量测定方法。为了有效地控制产品质量,笔者建立了TLC法对王不留行进行定性鉴别,采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定方中邻氨基苯甲酸及王不留行黄酮苷的含量。

1 材料

1.1 仪器

U3000型HPLC仪,包括LPG-3400SD型泵、WPS-3000SL型自动进样器、TCC-3000RS型柱温箱、VWD-3100型紫外检测器、Chromeleon色谱工作站(美国Dionex公司);92SM-202-A-DR电子分析天平(瑞士Precisa公司);UV-2401PC型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

复方王不留行片(白云山汤阴东泰药业有限责任公司,批号:130302、120606、130311、131104;焦作市博爱药业有限公司,批号:110621)。王不留行黄酮苷对照品(批号:111853-201001,纯度:91.7%)、王不留行对照药材(批号:121094-200703)均购自中国食品药品检定研究院;邻氨基苯甲酸对照品(批号:C1305010,纯度:99.5%)购自上海晶纯生化科技股份有限公司;聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂);甲醇为色谱纯,磷酸、乙醇、无水乙醇、三氯化铝均为分析纯,水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 王不留行的TLC鉴别

取本品,除去糖衣,粉碎,取粉末适量(约相当于王不留行1.0 g),置于锥形瓶中,加70%甲醇40ml,超声(功率:200 W,频率:40 kHz)处理30min,放冷,滤过,滤液作为供试品溶液。另取王不留行对照药材1 g,照上述供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。再取王不留行黄酮苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液。再取“2.2.2”项下缺王不留行的阴性样品适量,照上述供试品溶液的制备方法制成缺王不留行的阴性样品溶液。按TLC法[2]试验,吸取上述4种溶液各2μl,分别点于同一聚酰胺薄膜上,以无水乙醇-水(4∶6,V/V)为展开剂,展开,取出,晾干,采用2%三氯化铝乙醇溶液浸渍法显色,热风吹干,置紫外光灯(365nm)下检视。结果,供试品溶液中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,缺王不留行的阴性样品无干扰,详见图1。

图1 薄层色谱图1~3、7~8.5批样品;4.王不留行黄酮苷对照品;5.王不留行对照药材;6.缺王不留行的阴性样品Fig 1 TLC chromatograms1-3,7-8.test sample;4.reference substance of vaccarin;5.reference substance of Vaccaria segetalis;6.negative sample without V.segetalis

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱:YMC-Pack Pro C18(250mm×4.6mm,5 μm);流动相:甲醇为流动相A,0.3%磷酸溶液为流动相B,梯度洗脱,程序详见表1;流速:1.0ml/min;检测波长:280nm;柱温:35 ℃;进样量:10μl。

2.2.2 溶液的制备 (1)对照品溶液。精密称取王不留行黄酮苷对照品30.38mg,置于50ml量瓶中,用70%甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,作为王不留行黄酮苷对照品贮备液。再精密称取邻氨基苯甲酸101.08mg,置于50ml量瓶中,再精密量取上述王不留行黄酮苷对照品贮备液5ml,置于同一50ml量瓶中,用70%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。(2)供试品溶液。取样品40片,除去糖衣,精密称定,研细,精密称取适量(约相当于王不留行1.0 g),置于50ml量瓶中,加70%甲醇30ml,超声(功率:200 W;频率:40 kHz)处理30min,放置至室温,用70%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。(3)阴性对照溶液。按处方比例分别称取除邻氨基苯甲酸、王不留行外的其余各成分,按制备工艺分别制成缺邻氨基苯甲酸、王不留行的阴性样品,按上述供试品溶液制备方法,制成缺邻氨基苯甲酸、王不留行的阴性对照溶液。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Program of the linear gradient elution

2.2.3 系统适用性试验 精密吸取“2.2.2”项下的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。结果,供试品溶液中邻氨基苯甲酸和王不留行黄酮苷能达到基线分离,理论板数以王不留行黄酮苷计不低于5500,分离度>9.2;阴性对照溶液无干扰。色谱见图2。

图2 高效液相色谱图A.混合对照品;B.供试品;C.缺王不留行的阴性对照;D.缺邻氨基苯甲酸的阴性对照;1.邻氨基苯甲酸;2.王不留行黄酮苷Fig 2 HPLC chromatogramsA.mixed reference;B.test sample;C.negative sample without V.segetalis;D.negative sample without anthranilic acid;1.anthranilic acid;2.vaccarin

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液1、3、5、7、10、20μl,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱峰面积。以进样量(x,μg)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程为y王不留行黄酮苷=21.56x-0.100(r=0.9999);y邻氨基苯甲酸=3.755x+1.296(r=0.9999)。结果表明,王不留行黄酮苷和邻氨基苯甲酸的进样量分别在0.0557~2.2287、2.0114~40.2279μg范围内与各自峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10μl,按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次。结果,王不留行黄酮苷和邻氨基苯甲酸的峰面积的RSD分别为0.97%、0.38%,表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取供试品(批号:130302)溶液适量,分别于配制0、2、6、8、12h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。结果,王不留行黄酮苷和邻氨基苯甲酸峰面积的RSD分别为0.86%、0.79%(n=6),表明供试品溶液12h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取同一批样品(批号:130302)适量,按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果,样品中王不留行黄酮苷和邻氨基苯甲酸的平均含量分别为1.0102、32.016mg/g,RSD分别为1.01%、0.68%,表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品(批号:130302)细粉适量(约相当于王不留行0.5 g),共6份,分别置于50ml量瓶中,分别加入邻氨基苯甲酸对照品约50mg、“2.2.2”项下王不留行黄酮苷对照品贮备液3.0ml,加70%甲醇30ml,按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件测定并计算加样回收率,结果详见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)Tab 2 Results of recovery tests(n=6)

2.2.9 样品含量测定 取5批样品各适量,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.2.1”项下色谱条进行测定,以外标法计算,结果详见表3。

表3 样品含量测定结果(n=3)Tab 3 Results of content determination of samples(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择

精密称取王不留行黄酮苷和邻氨基苯甲酸对照品各适量,用70%甲醇配制成适宜浓度的溶液,照紫外-可见分光光度法在200~400nm范围内扫描吸收光谱。结果表明,王不留行黄酮苷在280nm波长处有最大吸收,邻氨基苯甲酸在217、243nm波长处均有最大吸收。由于处方中王不留行黄酮苷的含量相对较低,为使两种成分都有较好的响应,故选择280nm作为检测波长。

3.2 流动相的筛选

参考相关文献[1-8],本试验比较了多种流动相系统,分离效果均不理想。最终选用甲醇-0.3%磷酸溶液作为流动相,通过优化,使样品中邻氨基苯甲酸与王不留行黄酮苷色两组分达到基线分离,阴性对照样品无干扰,且各组分分离度良好,峰形佳。

3.3 耐用性考察

本文考察了YMC-Pack Pro C18(250mm×4.6mm,5 μm)、ZORBAX Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mm,5μm)、Thermo Syncronis C18(150mm×4.6mm,5 μm)等色谱柱对目标化合物分离度和含量测定结果的影响。结果表明,3个不同厂家的同类型色谱柱对样品含量测定结果没有显著影响,含量测定RSD<2.8%,分离度均>3.4。

3.4 TLC鉴别中展开系统和温度的考察

笔者曾采用甲醇-水(4∶6,V/V)、甲醇-水(1∶1,V/V)等展开系统对方中王不留行进行TLC鉴别,但阴性对照样品均有干扰,效果不佳。最终采用无水乙醇-水(4∶6,V/V)的展开系统,该方法阴性对照样品无干扰,斑点清晰,分离度好。试验中笔者还发现,温度对样品的分离度有较大影响,温度高时阴性样品干扰大,斑点分离度差,因此TLC鉴别时应控制温度在20℃以下。

3.5 含量测定结果分析

由本研究结果可知,不同厂家样品中王不留行黄酮苷的含量相差极大,且低于2010年版《中国药典》(一部)[1]中对王不留行药材最低限量(0.40%)的规定。分析原因,主要是由于原质量标准中无王不留行质量控制,厂家投料用饮片含量差异所致。为了更好地控制复方王不留行片的质量,保证用药安全、有效,有必要建立王不留行黄酮苷的含量控制标准。

综上所述,该方法操作简便、快捷,结果准确、重复性好,可作为复方王不留行片的质量控制方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社,2010:49、附录ⅥB.

[2]王玉霞,殷永伟,耿琴.HPLC测定肾石通颗粒中王不留行黄酮苷的含量[J].数理医药学杂志,2012,25(5):557.

[3]韩晋,李娜,刘冬,等.复方灵芝乳膏中王不留行黄酮苷含量测定方法研究[J].解放军药学学报,2012,28(5):415.

[4]孟贺,陈玉平,秦文杰,等.HPLC测定王不留行中王不留行黄酮苷的含量[J].中国中药杂志,2010,35(16):2072.

[5]张辉,陈乃江.HPLC法测定复方王不留行片中邻氨基苯甲酸的含量[J].现代中药研究与实践,2009,23(4):63.

[6]王小雪,郑文捷,谢国祥,等.高效毛细管电泳同时测定板蓝根中水杨酸、丁香酸、苯甲酸和邻氨基苯甲酸[J].中国中药杂志,2009,34(2):189.

[7]方建国,万进,汤杰,等.大孔吸附树脂分离纯化大青叶有机酸部位的实验研究[J].中国药房,2007,18(16):1214.

[8]王文清,张飞,方建国,等.反相高效液相色谱法测定大青叶中邻氨基苯甲酸与丁香酸的含量[J].医药导报,2005,25(5):456.

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