不同产地木瓜中绿原酸、原儿茶酸和总酚的含量测定Δ

韩 煜，杨 沫，谢晓梅，程菁菁，王 键（安徽中医药大学药学院/现代中药安徽省重点实验室/安徽省“115”新安医药研究与开发产业创新团队，合肥 230012）

中药木瓜又名皱皮木瓜，为蔷薇科木瓜属植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果实[1]，主产于安徽宣城、重庆綦江、湖北资丘及云南等地，历代本草以宣木瓜为道地药材。木瓜含有有机酸、三萜类、多酚和多糖等[2-4]。植物多酚是一类广泛存在于植物体内的复杂次生代谢产物。随着多酚类成分在抗氧化、抗癌、防治心血管疾病等多方面活性的研究不断深入[5-8]，植物多酚已成为当前研究的热点之一[9]。但目前鲜见中药木瓜多酚较为系统的研究报道。本文通过双波长切换高效液相色谱（HPLC）法和Folin-Ciocalteau比色法对国内主要产地木瓜中绿原酸、原儿茶酸和总酚含量进行比较，考察多酚与绿原酸、原儿茶酸含量的相关性，以为木瓜的质量控制和评价提供科学依据，并为其深度研究与开发利用积累试验资料。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括二元泵系统、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器和ChemStation色谱工作站（美国Agilent公司）；756MC型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；BP221D型电子天平（德国Sartorius公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q实验室超纯水器（美国Millipore公司）。

1.2 试剂

绿原酸对照品（批号:110753-200413）、原儿茶酸对照品（批号:110809-200604）和没食子酸对照品（批号:110831-200302）均由中国食品药品检定研究院提供；乙腈为色谱纯，磷酸、甲醇等为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

木瓜药材产地及收集地详见表1。所有样品经安徽中医药大学彭华胜教授鉴定为蔷薇科植物贴梗海棠C.speciosa（Sweet）Nakai的果实，用前粉碎，过80目筛，混合均匀。

表1 木瓜药材产地和收集地Tab 1 The different habitats and collected areas of C.sinensis

2 方法与结果

2.1 原儿茶酸和绿原酸的含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:Shim-pack CLC-ODS（M）柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相:乙腈-0.1%磷酸水溶液（15∶85，V/V）；检测波长为259nm和325nm，波长切换程序为:0～14min，259nm，14～25min，325nm；流速:0.5ml/min；柱温:25 ℃；进样量:20μl。理论板数以原儿茶酸和绿原酸峰计，分别为14000、14500，测量峰与相邻峰分离度均大于5。色谱详见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取原儿茶酸对照品7.07mg、绿原酸对照品7.24mg，分别置于5ml量瓶中，加50%甲醇使溶解，定容，摇匀，制成原儿茶酸、绿原酸对照品贮备液；精密移取原儿茶酸对照品贮备液0.5ml、绿原酸对照品贮备液2ml，分别置于10ml量瓶中，加50%甲醇定容，制成每1ml含原儿茶酸0.0707mg和绿原酸0.2896mg的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取木瓜供试品约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，密塞，称定质量，超声（功率:250 W，频率:40 kHz）处理30min，放冷，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.宣城木瓜（编号 6）；C.云南木瓜（编号13）；D.四川木瓜（编号11）；E.湖北木瓜（编号8）；1.原儿茶酸；2.绿原酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference；B.C.sinensis from Xuancheng（No.6）；C.C.sinensis Yunnan（No.13）；D.chaenomelis fructus from Sichuan（No.11）；E.C.sinensis from Hube（iNo.8）；1.protocatechuic acid；2.chlorogenic acid

2.1.4 检测波长和切换时间 采用二极管阵列检测器，在200～400nm波长范围扫描并记录与原儿茶酸、绿原酸保留时间相同的供试品色谱峰的紫外光谱，并与原儿茶酸、绿原酸光谱图比较。结果显示，供试品中与对照品保留时间相同的色谱峰，其紫外光谱与对照品一致，详见图2。依据所得光谱，分别选择原儿茶酸最大吸收波长259nm和绿原酸最大吸收波长325nm为各自的检测波长，结合供试品在259nm和325nm的色谱图，最终确定波长切换时间在进样14min时。

2.1.5 线性关系考察 分别精密吸取原儿茶酸对照品溶液0.5、3.0、10.0、30.0、35.0μl，绿原酸对照品溶液 1.0、2.0、5.0、10.0、15.0μl，按“2.1.1”项下色谱条件，依序注入HPLC仪，以色谱峰面积（y）为纵坐标，对照品进样量（x，μg）为横坐标，绘制标准曲线，得原儿茶酸的回归方程为y＝5603x+203.5（r＝0.9995），绿原酸的回归方程为y＝4075x+757.9（r＝0.9995）；表明原儿茶酸、绿原酸的进样量分别在0.0354～2.47、0.289～4.34μg范围内与各自峰面积呈良好的线性关系。

2.1.6 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液适量，按上述色谱条件连续进样5次测定。结果，原儿茶酸、绿原酸峰面积的RSD分别为1.52%、1.04%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品（编号6）溶液适量，分别于配制0、1、2、4、12h时按上述色谱条件进样测定。结果，原儿茶酸、绿原酸峰面积的RSD分别为2.90%、0.21%，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.1.8 重复性试验 取同一批木瓜供试品（编号6）6份，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，原儿茶酸、绿原酸含量的RSD分别为2.29%、1.80%，表明本方法重复性较好。

图2 紫外光谱图A.原儿茶酸；B.绿原酸；C.与原儿茶酸保留时间相同的成分；D.与绿原酸保留时间相同的成分Fig 2 UV spectrumA.protocatechuic acid；B.chlorogenic acid；C.compound with the same retention time as protocatechuic acid；D.compound with the same retention time as chlorogenic acid

2.1.9 加样回收率试验 取同一批已知含量的木瓜供试品（编号6）0.5 g，精密称定，分别准确加入一定量的原儿茶酸和绿原酸对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果详见表2。

表2 原儿茶酸和绿原酸的加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test of protocatechuic acid and chlorogenic acid（n＝6）

2.1.10 原儿茶酸和绿原酸的含量测定 取不同产地的木瓜供试品各适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算原儿茶酸和绿原酸含量。

2.2 总酚的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取置五氧化二磷干燥器中的没食子酸、绿原酸和原儿茶酸对照品适量，分别置于5ml量瓶中，加甲醇使溶解，定容，摇匀，制成每1ml含没食子酸0.199mg、绿原酸0.224mg和原儿茶酸0.193mg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取木瓜供试品0.1 g，精密称定，精密加入50%甲醇25ml，称质量，超声（功率:250 W，频率:40 kHz）处理30min，冷却，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，收集续滤液，即得。

2.2.3 检测波长和指标成分的选择 精密移取绿原酸、原儿茶酸和没食子酸对照品溶液及供试品溶液各适量，分别置于25ml量瓶中，加Folin-Ciocalteau试液1.0ml，超纯水10ml，用7.5%Na2CO3溶液稀释至刻度，摇匀，室温放置2 h，以空白试液为参照，在300～800nm波长范围内扫描，记录紫外吸收光谱，详见图3。结果表明，各对照品和供试品溶液显色后，吸收光谱相似，最大吸收均在763nm波长处；其中，没食子酸是2010年版《中国药典》（一部）总酚测量的指标成分[1]，课题组在对木瓜酚类成分预试验中，检出了原儿茶酸和绿原酸，较少检出没食子酸；考虑原儿茶酸较绿原酸易得，故选择原儿茶酸为木瓜总酚测量的指标成分。

图3 吸收光谱图1.没食子酸；2.原儿茶酸；3.木瓜供试品（编号 3）；4.绿原酸Fig 3 Absorption spectra1.gallic acid；2.protocatechuic acid；3.test sample of C.sinensis（No.3）；4.chlorogenic acid

2.2.4 线性关系考察 精密移取“2.2.1”项下原儿茶酸对照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，置于 25ml量瓶中，加Folin-Ciocalteau试液1.0ml，超纯水 10ml，用 7.5%Na2CO3溶液稀释至刻度，摇匀，室温放置2 h，以空白试液为参照，在763nm波长处测定吸光度。以对照品进样量（x，mg）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得原儿茶酸的回归方程为 y＝4.49x+0.0727（r＝0.9991），表明原儿茶酸进样量在0.0193～0.193mg范围内与吸光度线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密移取对照品溶液1.0ml，按上述方法测量吸光度，平行6次。结果，吸光度的RSD为0.45%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密移取供试品（编号3）溶液1.0ml，按上述方法操作，显色后分别于放置0、2、3、3.5、4 h时测定。结果，吸光度的RSD为0.89%，表明供试品溶液在4 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一木瓜供试品（编号3）0.1 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述方法操作，平行测定6次，计算总酚含量。结果，RSD为1.50%，表明本方法重复性较好。

2.2.8 加样回收率试验 取同一批已知含量的木瓜供试品（编号3）约50mg，精密称定，准确加入适量原儿茶酸对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述方法操作，计算加样回收率，结果详见表3。

2.2.9 总酚含量测定 取木瓜供试品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液；精密移取续滤液1.0ml，置于25ml量瓶中，加Folin-Ciocalteau试液1.0ml，超纯水 10ml，用 7.5%Na2CO3溶液稀释至刻度，摇匀，室温放置2 h，以空白试液为参照，在763nm处测定吸光度，按标准曲线法计算供试品中总酚含量。

表3 总酚的加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3 Result of recovery test of total phenolics（n＝6）

2.3 不同产地木瓜中总酚、绿原酸和原儿茶酸的含量测定结果

取不同产地木瓜供试品各适量，按“2.1.10”项下方法测定原儿茶酸和绿原酸含量，再按“2.2.9”项下方法测定总酚含量，结果详见表4。

表4 不同产地木瓜中总酚、绿原酸和原儿茶酸的含量测定结果（n＝2，%）Tab 4 Mass fractions of total phenolics，chlorogenic acid and protocatechuic acid in C.sinensis from different areas（n＝2，%）

3 讨论

绿原酸和原儿茶酸属于酚酸类化合物，分子结构中都同时存在多酚和羧酸官能团，是目前发现的木瓜多酚的主要成分。李霞等[10]采用梯度洗脱分离和254nm检测分析木瓜中绿原酸和原儿茶酸的含量。本法在等度洗脱的条件下，通过波长切换在绿原酸和原儿茶酸各自最大吸收波长处检测，提高了分析效率和检测灵敏度。预试验中对流动相组成（甲醇、乙腈、磷酸溶液及其体积比）、流速和柱温等进行考察，最终确定为本研究中所用的分离条件。

总酚的含量测定常用Folin-Ciocalteau比色法[11]和三氯化铁-铁氰化钾比色法[12]。前期试验对两种方法进行了考察，发现在木瓜的总酚的含量测定中，后者显色后吸光度稳定时间较短，方法学考察项目的RSD较前者稍难以控制，故采用了Folin-Ciocalteau比色法。依据2010年版《中国药典》（一部）附录收载方法[1]并进行优化，对不同提取溶剂（10%、30%、50%、70%甲醇）进行了提取试验，对不同超声提取时间（10、30、60min）进行了试验，以及对Folin-Ciocalteau试液加入量、显色后暗处放置时间和Na2CO3溶液体积分数进行试验，最终确定了本研究中木瓜总酚的最佳测量条件。

木瓜具有舒筋活络、和胃化湿的功效，但目前对其功效的物质基础还不甚明了。本课题组基于对中药物质基础“具有三个层次多维结构”[13]的认识，对宣木瓜组分进行较为系统的分析检测，已开展宣木瓜总三萜和单体成分齐墩果酸熊果酸[14]、宣木瓜总有机酸和单体有机酸、宣木瓜总多糖和单体多糖的含量分析研究。从本研究结果看，不同产地木瓜均含有总酚、绿原酸和原儿茶酸；总酚质量分数为0.87%～3.77%，平均值2.16%；绿原酸质量分数为0.053%～0.387%，平均值0.192%；原儿茶酸质量分数为0.024%～0.541%，平均值0.087%；不同产地总酚含量高低顺序为:云南木瓜＞宣木瓜＞川木瓜＞湖北木瓜；绿原酸和原儿茶酸总量的产地高低顺序与总酚相同。Pearson相关系数为0.719（P＜0.01），表明总酚含量与绿原酸和原儿茶酸总量之间存在一定正相关性。在对绿原酸与原儿茶酸含量比例分析中发现，所测样品中宣木瓜均处于较高的比值水平，且绿原酸和原儿茶酸总量占总酚含量比例也处于较高值，数值相对稳定，这一现象是否附有产地特征尚需进一步研究。

综上所述，本文所建方法简便、准确、重复性好，可综合用于木瓜的质量分析。

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