长波紫外线诱导成纤维细胞急性光损伤模型的建立

郑锦芬，石翠萍，赖 维，陆 春

• 论 著 •

长波紫外线诱导成纤维细胞急性光损伤模型的建立

郑锦芬，石翠萍，赖 维，陆 春

郑锦芬

目的 建立长波紫外线（UVA）诱导的成纤维细胞急性光损伤模型。方法 原代培养人皮肤成纤维细胞，采用形态学观察、免疫荧光细胞染色对皮肤成纤维细胞进行鉴定，分别用形态学观察、CCK-8法、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色检测UVA对细胞形态、增生活性以及细胞衰老状态的影响。结果 UVA剂量 ≤4 J/cm2时对细胞形态无明显影响，而UVA剂量≥6 J/cm2时细胞出现变形；UVA剂量≤4 J/cm2时，细胞增生率均＞85%，而UVA剂量≥6 J/cm2时细胞增生率明显下降，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）； 4 J/cm2组的衰老阳性细胞明显增加，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 4 J/cm2UVA可用于建立人皮肤成纤维细胞急性光损伤模型。

长波紫外线；成纤维细胞；光损伤

[J Pract Dermatol, 2015, 8(6):401-405]

皮肤光老化作为一个独立的疾病或综合征已成为国内外研究的热点。到目前为止，皮肤光老化及其相关疾病的发病机制仍不清楚。简单的成纤维细胞是研究皮肤光老化的一个很好模型。单层细胞培养模型则便于紫外线（ultraviolet，UV）照射，由此成为当今研究皮肤光老化发生机制和抗光老化物质功效性研究的首选。紫外线按其波长可分为长波紫外线（UVA，320～400 nm）、中波紫外线（UVB，280～320 nm）和短波紫外线（UVC, 200～280 nm）[1]。对皮肤而言，受UV照射影响的主要是UVA和UVB。以往人们认为UVB是引起皮肤光老化的主要类型，然而近年来越来越多的研究证明UVA才是引起皮肤光老化的主要类型[2]。UVA与皮肤光老化密切相关[3]。然而，到目前为止尚无关于UVA诱导成纤维细胞急性光损伤模型建立的标准。鉴于此，笔者探讨了UVA诱导成纤维细胞急性光损伤模型建立的方法与标准，为研究皮肤光老化发生机制和抗光老化物质功效性研究提供可靠的体外试验模型。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料选用6例6～8岁青少年包皮环切术后包皮组织，取包皮组织前已取得患者家属的知情同意，并经过中山大学附属第三医院伦理委员会批准[编号：中大附三医伦（2010）2-22号]。高糖培养基（dulbecco's modified eagle's media，DMEM）、胰酶、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、青链霉素（美国Gibco公司）；细胞衰老β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色试剂盒（美国Biovision公司）；抗人波形蛋白抗体、抗人纤维连接蛋白抗体、抗人肌间线蛋白抗体、人成纤维细胞表面蛋白抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗（美国Abcam公司）；4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、Ⅰ型胶原酶、二甲基亚砜（美国Sigma公司）；CCK-8（cell counting kit-8）试剂（日本Dojindo公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 按照文献[4]中的方法进行培养。以DMEM作为基础培养基，其中添加胎牛血清（10%）、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 µg/ml）。取第3或第4代细胞进行试验。

1.2.2 成纤维细胞的鉴定 ①形态学观察：取第2或第3代培养的细胞在倒置显微镜下观察并摄像。②免疫荧光细胞染色：待细胞融合＞80%时，调节细胞密度为每孔1×104细胞接种于48孔培养板中。无水甲醇固定细胞，加入含1% BSA的磷酸盐缓冲液（PBS）封闭抗体的非特异性结合位点，加入一抗，一抗分别为抗人纤维连接蛋白抗体、抗人波形蛋白抗体、抗人成纤维细胞表面蛋白抗体、抗人肌间线蛋白抗体。加入二抗后DAPI染色，在荧光倒置显微镜下观察细胞染色情况，并摄像。

1.2.3 UVA照 射当成纤维细胞生长至80%～90%融 合时，予以UVA照射。UVA光源采用UVA紫外线照射仪（SIGMA SS-03，中国），UVA强度的检测使用紫外线强度检测仪（SIGMA，中国）。将细胞用37 ℃预热的PBS洗2次。每孔加入等量的薄层PBS，然后用不同剂量的UVA照射。

1.2.4 形态学观察 试验设0、2、4、6、8、10 J/cm26个组。取对数生长的成纤维细胞用0.25%胰酶消化，将细胞以每孔2 ×104细胞的密度接种于12孔板中，培养24 h后各组予以不同剂量的UVA照射，照射后24 h、48 h和72 h在倒置显微镜下观察细胞形态，并摄像。

1.2.5 细胞增生活性测定 用CCK-8法测定细胞增生率，设0、 2、4、6、8、10 J/cm26个组，将成纤维细胞按每孔5 ×103细胞密度接种于96孔培养板中，每孔100 µl含细胞的培养液，每组各设3个复孔，培养24 h后每孔加入10 µl CCK-8试剂，37 ℃孵育4 h，在酶联免疫检测仪上测定450 nm的吸光度。试验重复3次。

1.2.6 SA-β-gal染色 由于形态学观察试验发现细胞经6 J/cm2UVA照射后出现细胞崩解、死亡，因此本试验分成0、2、4 J/cm23组。将细胞接种于12孔板中，予以不同剂量的UVA照射，照射后进行SA-β-gal染色。加入预配好的固定液室温固定，加入500 µl预配好的染液，37 ℃孵育过夜。

1.3 统计学方法

所有试验重复至少3次，试验结果采用SPSS13.0统计软件对数据进行方差分析（ANOVA）。试验数据以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成纤维细胞的鉴定

2.1.1 人皮肤成纤维细胞的形态 显微镜下见成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、多角形和扁平星形。传代后24 h细胞密度仍较低，此时可见细胞胞体较大，多呈扁平星形和多角形，有较多且较短的突起，胞核也较大。传代后72 h细胞密度较高，呈鱼梭状排列，细胞多呈梭形或圆形，胞体较小，胞突少而长，胞核较小。传代后48 h的细胞密度和形态介于24～72 h（图1）。

图1 人皮肤成纤维细胞传代培养24 h、48 h和72 h的细胞形态及密度

图2 人皮肤成纤维细胞在倒置显微镜下的表型特征

2.1.2 人皮肤成纤维细胞的表型 图2所示培养的细胞明显表达成纤维细胞特异性表面标志，包括纤维连接蛋白、波形蛋白、纤维母细胞表面蛋白和肌间线蛋白。

2.2 成纤维细胞急性光损伤模型的建立

2.2.1 UVA对人皮肤成纤维细胞形态的影响 与0 J/cm2组相比，2 J/cm2组和4 J/cm2组的细胞在UVA照射后24 h形态无明显改变，6 J/cm2组有少部分细胞变形，表现为整个细胞发生崩解、碎裂，结构被破坏，胞质混浊，胞质内颗粒增多呈颗粒状，细胞核折光性下降（图3箭头所示）。8 J/cm2组孔中央的细胞大部分发生变形，而10 J/cm2组孔中央的细胞几乎全部发生变形，仅孔周围的细胞形态正常。UVA照射后48 h 和72 h，与0 J/cm2组相比，2 J/cm2组和4 J/cm2组的细胞形态均无明显改变，6 J/cm2组见较多漂浮的死亡细胞，8 J/cm2组 和 10 J/cm2组仍可见较多的变形细胞和漂浮的死亡细胞，变形细胞较24 h减少，正常形态的细胞较24 h增多。

图3 不同照射剂量及时间的UVA对人皮肤成纤维细胞形态的影响（×200）

2.2.2 UVA对皮肤成纤维细胞增生活性的影响UVA照射后24 h，0～10 J/cm2的UVA可呈剂量依赖性抑制细胞增生。UVA剂量≤4 J/cm2时，细胞增生活性均＞85%。而UVA剂量≥6 J/cm2时，细胞存活率明显下降，与对照组相比差异有统计学意义（P ＜0.01）（图4）。

图4 不同剂量UVA对人皮肤成纤维细胞增生活性的影响

2.2.3 UVA对皮肤成纤维细胞SA-β-gal表达的影响

SA-β-gal染色是目前检测细胞衰老最常用的方法之一[5]，阳性反应者细胞质呈蓝色。由于前面的形态学观察和细胞增生活性测定发现UVA≥6 J/cm2时出现细胞变形，且细胞增生率明显下降，因此本试验选用≤4 J/cm2UVA剂量检测UVA对细胞衰老状态的影响。结果发现，与0 J/cm2组相比，2 J/cm2组SA-βgal染色阳性细胞增加不明显，而4 J/cm2组的SA-βgal染色阳性细胞则明显增加，差异有统计学意义（P ＜0.01）（表1、图5）。

表1 不同剂量UVA对人皮肤成纤维细胞SA-β-gal表达的影响 （±s）

表1 不同剂量UVA对人皮肤成纤维细胞SA-β-gal表达的影响 （±s）

注：SA-β-gal阳性率=连续4个视野的阳性细胞数/细胞总数；与（0 J/cm2）比较，**P ＜ 0.01

剂量（J/cm2） SA-β-gal染色阳性细胞率（%）0 19.92±7.18 2 20.67±10.06 4 30.21±9.72**

3 讨论

皮肤光老化的试验模型包括人体、动物和体外3种模型。在人体上进行的试验是很有限的，一般只有在不损害人体健康的前提下才能进行人体试验。因此人们研究光老化的组织学、生物学尤其是发生机制时往往在动物或者体外模型上进行。如今，动物模型和体外模型的研究已经取得很大的发展，成为当今研究皮肤光老化的重要工具。光老化动物模型大多采用UV照射的Hr小鼠和豚鼠[6,7]。大量研究证实，成纤维细胞经单次或多次照射UVA或者UVB的情况下便能激活光老化相关的信号通路，并引起老化相关蛋白的表达，从而奠定了成纤维细胞急性光损伤模型在皮肤光老化研究领域的地位。因此，成纤维细胞急性光损伤模型已成为当今研究皮肤光老化发生机制和抗光老化物质功效性研究的首选[8]。

目前，尚无关于成纤维细胞急性光损伤模型建立的标准。在研究抗光老化物质的功效时，人们多采用单次UV照射的方法。由于在过去人们认为UVB是引起皮肤光老化的紫外线光谱，因此过去建立成纤维细胞急性光损伤模型多采用UVB光谱。近年来，人们发现UVA才是引起皮肤光老化的主要类型[2]，UVB主要与灼伤和皮肤癌有关，而UVA则与皮肤光老化密切相关[3]。另外，由于UVB的穿透能力较差，一般无法达到真皮层，而UVA的穿透能力强，可以直达皮肤的真皮层。本文的研究对象成纤维细胞主要存在于真皮层，因此选用UVA照射成纤维细胞建立急性光损伤模型。然而，到目前为止，利用UVA建立成纤维细胞急性光损伤模型的研究甚少，且缺乏统一的模型建立的方法及评价标准。鉴于此，我们探讨了UVA诱导的成纤维细胞急性光损伤模型建立的方法与标准，为研究皮肤光老化发生机制和抗光老化物质功效性研究提供可靠的体外试验模型。

图5 不同剂量UVA对人皮肤成纤维细胞SA-β-gal表达的影响

在模型建立过程中，UVA照射剂量是最关键的，也是最难确定的因素。剂量过大容易引起细胞死亡，导致模型建立失败；剂量太小又不能诱导出典型的光老化生物化学特征。为了找出一个使细胞产生急性光老化效应但又不至于引起细胞明显死亡的UVA剂量，笔者采用形态学观察、细胞增生活性测定及SA-β-gal染色3种试验方法共同确定。首先，通过形态学观察初步确定不引起细胞死亡的UVA剂量。试验结果发现，UVA剂量≤4 J/cm2时对细胞形态无明显影响，而UVA在剂量≥6 J/cm2时细胞出现变形，表现为整个细胞发生崩解、碎裂，结构被破坏，胞质混浊，胞质内颗粒增多呈颗粒状，细胞核折光性下降，漂浮的死亡细胞也明显增多。该结果提示UVA≥6 J/cm2时细胞即出现不可逆的死亡。随后，用CCK-8法检测了不同剂量UVA对成纤维细胞增生活性的影响，结果发现成纤维细胞的增生活性随UVA的剂量升高而降低。UVA在剂量≤4 J/cm2时，细胞增生率均＞85%。而UVA剂量≥6 J/cm2时细胞增生率明显下降，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。上述两个试验结果提示UVA≤4 J/cm2时不会引起成纤维细胞明显死亡。最后，为了在UVA≤4 J/cm2范围内找到一个使细胞产生急性光老化效应的剂量，采用SA-β-gal染色检测UVA对细胞衰老状态的改变。试验结果发现与0 J/cm2组相比，2 J/cm2组SA-β-gal染色阳性细胞增加不明显，而4 J/cm2组的阳性细胞则明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。因此，4 J/cm2UVA可用于建立人皮肤成纤维细胞急性光损伤模型。

在建立模型时应注意以下几点：①在用UVA照射仪测定UVA强度时，应把UVA照射仪放在拟放细胞处测量，否则造成UVA强度的测得值与实际值不符，因为UVA强度在UVA灯管下的不同位置而不同，即细胞所在位置的UVA强度与UVA灯管与细胞间的垂直距离呈负相关。为了保证试验的可重复性，细胞的放置位置及UVA灯管与细胞的放置位置间的垂直距离应固定，使其成为不变（固定）因素。根据公式：紫外线的有效剂量=紫外线的有效照射强度×被照射的时间。将细胞所受到的有效照射强度设定成固定因素，便可通过调整照射时间随机调整UVA照射剂量。② UVA对细胞的生物学效应不仅与UVA的剂量有关，也与PBS的量（高度）密切有关。在UVA照射细胞时需用PBS溶液代替DMEM培养基，防止后者中的成分对UVA的吸收作用或者遮挡作用。虽然PBS溶液是透明的，但是在试验中发现其对UVA仍有遮挡作用，从而影响了细胞对UVA的生物学效应。例如，在6孔培养板的不同孔中加入不等量的PBS溶液，细胞照射等剂量的UVA后，PBS量少的孔成纤维细胞更易出现形态改变及死亡，而PBS量多者则不容易出现上述改变。因此，为了保证各试验组所照射的UVA剂量是等同的，必须使各试验组的PBS量（高度）相同。同时，根据试验目的需要更换底面积不同的培养皿时，需要根据新旧培养皿底面积之间的倍比关系换算新培养皿所需的PBS量，以保证PBS的高度不变。由此可见，人皮肤成纤维细胞急性光损伤模型的建立是整个试验条件体系的建立，而不仅仅是UVA剂量这一单纯因素的确立。

本研究的目的是建立人皮肤成纤维细胞急性光损伤模型，为此，需找出一个使细胞产生急性光损伤效应但又不至于引起细胞明显死亡的UVA剂量。结果发现UVA= 4 J/cm2时细胞未见形态改变且细胞存活率在85%以上，并可诱导细胞衰老。这说明我们所建立的人皮肤成纤维细胞急性光损伤模型是成功的。

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Establishment of fibroblast model of acute photodamage

ZHENG Jin-fen，SHI Cui-ping，LAI Wei，et al
Department of Dermatology, Shenzhen Center for Chronic Disease Control and Prevention, Shenzhen 518020, China

Objective To establish the fibroblast model of acute photodamage. Methods Primary human dermal fibroblasts were cultured and identified by morphology and immunofluorescence staining. The cellular morphology, viability, cellular senescent state of the UVA-exposed fibroblasts were analyzed by morphology, CCK-8 and senescence associated-β-galactosidase(SA-β-gal) staining, respectively. Results Our experiment showed that UVA, with the doses less than 4 J/cm2, did not change the morphology of the fibroblasts and resulted in more than 85% viable cells. However, the cellular morphology was changed when the cells exposed to UVA with the doses of 6 J/cm2or greater. In addition, compared to the control group, the viable cells were decreased significantly (P＜0.01) when the cells were irradiated by UVA with the doses of 6 J/cm2or greater. The group irradiated by UVA with 4 J/cm2had significantly more (P＜0.01) SA-β-gal positive cells compared to the control group. Conclusion The 4 J/cm2of UVA could be used to establish the fibroblast model of acute photodamage.

Ultraviolet A；Fibroblast；Photodamage

R454.2；R329.27

A

1674-1293(2015)06-0401-05

2015-05-25

2015-09-04）

（本文编辑 耿建丽）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20150601

中华医学会-欧莱雅中国人健康皮肤研究项目（编号：S2011080801）；深圳市医疗卫生类科研项目（编号：201303108）

518020 深圳，深圳市慢性病防治中心（郑锦芬）；暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院（石翠萍）；中山大学附属第三医院（赖维，陆春）

郑锦芬，博士，主治医师，研究方向：皮肤老化的分子生物学机制，E-mail: zhengjinfen@aliyun.com