云南省迪庆藏族自治州19株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌分子流行病学分析

杨丽天,何寸英,秦䶮涛,古文鹏

（1.迪庆州疾病预防控制中心，云南 迪庆 674400；2.云南省疾病预防控制中心，云南 昆明 650000）

● 疾病控制与防治 ●

云南省迪庆藏族自治州19株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌分子流行病学分析

杨丽天1,何寸英1,秦䶮涛1,古文鹏2

（1.迪庆州疾病预防控制中心，云南 迪庆 674400；2.云南省疾病预防控制中心，云南 昆明 650000）

[目的]对云南省迪庆藏族自治州2012-2013年两家医院分离的金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株进行了分子流行病学分析，以此了解该地区MRSA耐药情况。[方法]采用脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Feld Gel Electrophoresis ,PFGE）、多位点测序分析（multilocus sequence typing ,MLST），药物敏感试验和毒力基因检测等方法对19株MRSA进行分析研究。[结果]所有菌株对β-内酰胺类抗生素耐药，部分菌株对喹诺酮类、大环内酯类、四环素以及磺胺类药物耐药；毒力基因检测结果表明，所有菌株均携带有溶血素基因以及不同组合的肠毒素基因；PFGE结果显示19个菌株共产生11个PFGE带型，具有非常高的分辨率水平；MLST分型结果显示，19株MRSA共产生3个ST型别，其中以ST59和ST121型菌株为主。[结论]云南省迪庆藏族自治州MRSA菌株耐药水平不容忽视，菌株的毒力基因携带情况增加了病原菌的致病能力；MRSA的流行株在迪庆藏族自治州地区均有不同程度的分布，同时PFGE对MRSA的分型水平高于MLST，同时又与MLST分型方法具有良好的相关性。

金黄色葡萄球菌；耐药菌株；分子特征；迪庆藏族自治州

金黄色葡萄球菌是临床上一类非常重要的条件致病菌，虽然其是人体内微生物菌群的正常组分之一，但该菌可通过不同的机制致病引起人类广泛的感染和一系列临床症状的发生[1]。近年来，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的发病水平逐渐升高，成为医院获得性或是社区获得性感染的重要来源之一，已经成为世界范围内需要共同面对的严重问题[2-4]。因此，加强监测力度和对病原菌进行分子特征方面的分析具有十分重要的临床意义。

迪庆藏族自治州位于云南省西北高寒地区，毗邻西藏，是云南省地理位置、气候条件较为特殊的地区之一。既往对于该地区的金黄色葡萄球菌的监测和研究几乎没有报道过，这是第一次对迪庆藏族自治州分离的金黄色葡萄球菌的分子特征进行系统的分析和研究。

目前，对于金黄色葡萄球菌主流的分子分型方法主要有PFGE、MLST、spa Typing以及SCCmec typing等[5]。PFGE被认为是对金黄色葡萄球菌分子分型的金标准，被认为具有较高的分辨率水平，而MLST则主要应用于菌株的克隆群和进化关系的研究，其它分型方法也均具有各自的适用性并具有较高的分辨率[6]。为了从菌株的整个基因组角度进行分析研究，选取了PFGE和MLST两种分型方法，并结合药敏试验和毒力基因检测等对迪庆藏族自治州分离的金黄色葡萄球菌菌株进行研究。

1 材料和方法

1.1 实验材料——菌株来源

19株金黄色葡萄球菌来源于2012-2013年，从迪庆藏族自治州两家三甲医院分离得到。其中菌株1-5为2012年从A医院分离；菌株5-9为2013年从A医院分离得到。菌株10-14为2012年从B医院分离；菌株15-19为2013年从B医院分离得到。其中，10株菌（52.63%）从患者的鼻炎抽吸物中分离得到；4株菌（21.05%）从患者的痰液中分离得到；5株菌（26.32%）从患者的血液中培养出来。13株菌（68.42%）是从5岁以下的婴幼儿中分离得到的，占分离菌株的主要部分。所有患者均有不同程度的发热、咳嗽、咳痰等临床表现。

1.2 实验方法

1.2.1 药敏试验

所有菌株均采用Vitek Compact2（梅里埃）生化鉴定仪进行生化鉴定和复合，采用Vitek Compact2（梅里埃）微生物鉴定仪进行药物敏感试验，并严格按照仪器说明进行试验操作。采用革兰氏阳性鉴定卡测定每个菌株的最低抑菌浓度值（MIC）。革兰氏阳性菌药敏板包被的抗生素依次为：青霉素G（PEN），氨苄西林（AMP），苯唑西林（OXA），庆大霉素（GEN），环丙沙星（CIP），氧氟沙星（LEV），莫西沙星（MXF），红霉素（EM），克林霉素（CM），奎奴普丁-达福普汀（QDA），万古霉素（VAN），四环素（TET），呋喃妥英（NIT），利福平（RIF）和复方新诺明（SXT）15种抗生素。采用ATCC29213金黄色葡萄球菌作为质控菌株，按照临床微生物实验室诊断标准（CLSI 2011版）进行结果的判定。同时，按照参考文献中的引物和方法扩增mecA基因，以确认耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌携带的基因。

1.2.2 毒力基因检测

将菌株接种于血平板，37℃在5%CO2中培养24 h，然后采用细菌基因组核酸提取试剂盒提取菌株的核酸。毒力基因检测按照参考文献中的引物进行PCR扩增。采用Bio-Rad mycycler型PCR仪进行扩增，扩增体系采用20 µl：Taq premix（TaKaRa）10 µl，水8 µl，上下游引物各0.5 µl，模板1 µl。扩增条件为94℃ 5 min, 然后按照30个循环94℃ 15 s, 55℃ 30 s，72℃ 30 s，最后72℃ 10 min。扩增产物采用1.5%的琼脂糖进行凝胶电泳，结果用Bio-Rad（Gel Doc）凝胶成像仪进行观察结果。

1.2.3 PFGE

按照PulseNet的PFGE操作方式进行实验，每个胶块采用50 U的SmaI（TaKaRa）于37℃酶切4 h，采用CHEF Mapper（Bio-Rad）进行电泳，电泳结束后采用GelRed对胶块染色30 min后用凝胶成像仪观察结果。1.2.4 MLST

MLST按照MLST数据库（http://saureus.mlst.net）公布的方法进行，扩增基因为arcC, aroE, glpF, gmk, pta, tpi, 和 yqiL。扩增引物和扩增体系等参数均按照MLST数据库，网站上提供的参数进行，扩增产物经切胶回收后纯化送到生物公司进行双向测序，并将测序结果提交到MLST数据库中查询每个等位基因号和每个菌株的ST型别。

2 结果

19株MRSA的药敏实验结果显示，所有菌株均对苯唑西林耐药，因此为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。所有菌株均对青霉素G和氨苄西林等β-内酰胺类抗生素耐药；8株菌（45.61%）显示为对环丙沙星耐药，其余菌株则表现为敏感或是中度敏感；2株菌（10.53%）显示对左氧氟沙星耐药，而大部分菌株则表现为中度敏感；12株菌（63.16%）表现为对红霉素耐药；6株菌对四环素耐药，占29.82%；15株菌对复方新诺明耐药，占77.19%；所有菌株对奎奴普丁—达福普汀和利福平均敏感。

菌株的毒力基因检测结果显示：所有菌株均携带溶血素基因；19株菌（96.49%）携带有不同程度组合的肠毒素基因；3个菌株携带eta以及etb等表皮剥脱毒素基因；10个菌株携带有杀白细胞毒素基因；11个菌株携带表皮细胞分化抑制基因。在所有的毒力基因检测结果中，肠毒素基因see，毒性休克综合征毒素tst以及杀白细胞毒素lukM的基因检测结果全为阴性。

PFGE结果显示，19个菌株共产生11个PFGE-SmaI带型，见图1所示。部分菌株形成一个单独的聚类型别，部分菌株具有相同的PFGE带型。其中来源于A和B医院的菌株形成了两个单独的聚类群，从每个医院分离得到的菌株具有较高的相似性，而不同医院分离的菌株则形成了不同的聚类群。MLST分型结果显示：菌株1、2、4、5、7、8、9为ST59型菌株，3、6菌株为ST6型菌株；而菌株10-19则全为ST121型。

3 讨论

MRSA目前已经成为全世界需要共同面对的公共卫生问题，其造成的院内感染或是社区获得性感染给经济和人类社会的发展带来了沉重的负担，摸清MRSA菌株的流行规律和分子特征有利于加强对该类菌株引起感染的控制[7]。既往对于云南省迪庆州的MRSA鲜有报道，而大部分研究主要在经济较为发达的地区，这是首次对云南省迪庆州分离的MRSA菌株进行分子特征方面的研究和分析，对全面了解云南省MRSA的分布特征和流行规律进行了补充和完善。

在研究结果中，19株MRSA菌株中有68.42%的菌株是分离自5岁以下的儿童，其中有很大一部分是从新生儿中分离得到的，这些患者均有不同程度的发热和肺炎等临床表现。这些病例特征与国内外的研究报道是一致的，表明儿童是MRSA感染的主要群体[8]。同时，药敏试验结果显示迪庆州分离的MRSA菌株除了对β-内酰胺类抗生素耐药外，对于喹诺酮类、大环内酯类、四环素以及磺胺类的耐药性菌株比例也占很大一部分，这给临床用药带来了许多问题和困难，因此加强对MRSA菌株的药敏监测并及时反馈给临床医师对于控制MRSA的感染具有十分重要的意义。

图1 19株MRSA菌株PFGE聚类分析

通过PFGE与MLST结果比较后发现，对MRSA而言，PFGE比MLST具有更高的区分效率，见图1。19株MRSA形成了11个PFGE聚类群，而仅产生了3个ST型别，因此PFGE对于MRSA具有较高的分辨率水平[9,10]。同时，PFGE也能很好的反映菌株的流行病学相关性，从研究可以看出从迪庆州不同医院分离菌株的PFGE带型具有较大的差异，形成了两个大的聚类群，说明不同医院的流行株是不同的克隆群，这对于加强院内感染的控制显得十分重要。

[1] ENRIGHT,M C ,D A ROBINSON,G RANDLE,et al.The Evolutionary History of Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) [J].Proc Natl Acad Sci U S A A,2002,99(11): 7687-7692.

[2] MCVICKER,G,T K PRAJSNAR,A.WILLIAMS,et al.Clonal Expansion During Staphylococcus Aureus Infection Dynamics Reveals the Effect of Antibiotic Intervention[J].PLoS Pathog Pathog,2014,10(2):e1003959.

[3] PETRY,V,G R BESSA,C S POZIOMCZYCK,et al.Bacterial Skin

Colonization and Infections in Patients with Atopic

Dermatitis [J].An Bras Dermatol Dermatol,2012,87(5): 729-734.

[4] POLISENA,J,S Chen,K Cimon,et al. Clinical Effectiveness of Rapid Tests for Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) in Hospitalized Patients: A Systematic Review [J].BMC Infect Dis Dis,2011,11:336.

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[6] SONG,J H ,P R Hsueh,D R CHUNG,et al. Spread of Methicillinresistant Staphylococcus Aureus Between the Community and the Hospitals in Asian Countries: an ANSORP Study [J].J Antimicrob Chemother Chemother,2011,66(5):1061-1069.

[7] LI,J ,L WANG,M Ip,et al.Molecular and Clinical Characteristics of Clonal Complex 59 Methicillin- resistant Staphylococcus Aureus Infections in Mainland China [J]. PLoS One One,2013,8(8):e70602-70603.

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（本文编辑：闫云丽）

Analysis on 19 MRSA molecular epidemiology in Diqing prefecture of Yunnan province

YANG Li-tian1, HE Cun-ying1, QIN Yan-tao1, GU Wen-pen2
(1. Diqing Center for Diseases Control and Prevention，Diqing Yunnan 674400, China 2.Yunnan Center for Diseases Control and Prevention，Kunming Yunnan 650000, China )

ObjectiveWe do epidemiological analysis on isolated MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus )bacteria strain in two hospitals from 2012 to 2013 in Diqing.MethodsAnalysis is by Pulsed-feld gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST) methods. Analyzes and studies 19 strain MRSA by drug sensitivity test and virulence genes test detection.ResultsThe results shows all the MRSA were resistant to β-lactamase antibiotics, parts of the strains were resistant to quinolone, macrolides, tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole. All the MRSA had the hemolysin genes, and different combined enterotoxin genes. 11 PFGE patterns and 3 ST types were shown for all the MRSA, ST59 and ST121 were the major types.ConclusionsThe antibiotics resistant problem become serious issue in Diqing prefecture, and different virulence genes increased the pathogenic abilities of the bacteria. PFGE shows the higher discriminatory power than MLST typing method for MRSA; meanwhile, the PFGE results had the well correlation with the MLST typing results in our study.

MRSA, tolerance, molecular features,Diqing prefecture

R181.2+6

A

1003-2800(2015)03-0172-03

2014-09-11

国家科技重大专项（2012ZX10004-212）

杨丽天（1966-），男，云南丽江人，专科，主管医师，主要从事流行病学方面的研究。

古文鹏（1982-），男，云南昆明人，硕士，技师，主要从事病原微生物学方面的研究。