凉血解毒汤对银屑病小鼠皮肤组织CCL20/CCR6表达的影响*

王颖，底婷婷，阮智通，赵京霞△，李萍△

(1首都医科大学附属北京中医医院，2北京市中医研究所，北京 100010)

凉血解毒汤对银屑病小鼠皮肤组织CCL20/CCR6表达的影响*

王颖1，2，底婷婷2，阮智通1，2，赵京霞2△，李萍1，2△

(1首都医科大学附属北京中医医院，2北京市中医研究所，北京 100010)

目的:观察凉血解毒汤对银屑病小鼠皮肤组织中CC趋化因子配体20(CCL20)/CC趋化因子受体6(CCR6)表达的干预作用。方法:24只BALB/c雄性小鼠随机分为空白对照组、银屑病模型组、凉血解毒汤中药治疗组和趋化因子CCL20单克隆抗体(阳性药)治疗组。用咪喹莫特诱导小鼠银屑病模型，采用银屑病皮损面积和疾病严重程度(psoriasis area and severity index，PASI)评分标准观察银屑病样小鼠皮损的变化情况。光镜下观察皮损组织形态学变化，测量表皮层厚度。采用real－time PCR检小鼠皮肤组织样本中CCL20和CCR6表达的变化。结果:银屑病模型组小鼠皮肤出现大量鳞屑和红斑，表皮增厚;与银屑病模型组小鼠比较，凉血解毒汤组小鼠银屑病样皮损程度较轻，红斑、鳞屑以及表皮增厚程度轻于模型组，PASI分数降低，皮肤组织CCL20以及CCR6的表达明显低于模型组。趋化因子CCL20单克隆抗体治疗组小鼠银屑病皮损程度较轻，红斑、鳞屑以及表皮增厚程度轻于模型组，PASI分数降低，皮肤组织CCL20以及CCR6的表达明显低于模型组。结论:凉血解毒汤可能通过下调CCL20/CCR6的表达来减轻银屑病小鼠的皮肤病变。

银屑病;CC趋化因子配体20;CC趋化因子受体6;凉血解毒汤

银屑病(psoriasis)是一种多基因决定、多环境因素刺激诱导的免疫异常性、慢性炎症性增生性皮肤病［1］，中医学称之“白疕”，典型皮损为境界清楚的具有银白色鳞屑的红色斑块，轻者可以在四肢关节部位出现银币大小的斑块，重者可以累及全身。病理表现为角质形成细胞异常增生伴有角化不全以及炎性细胞浸润和新生血管形成［2］。活化的角质细胞产生的CC趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20，CCL20)及CC趋化因子受体6(CC chemokine receptor 6，CCR6)可以介导免疫细胞向皮损部位迁移并诱导分泌促炎因子从而加重银屑病皮损［3］。凉血解毒汤(Liangxue－Jiedu prescription，LXJD prescription)是中医针对银屑病血热证的有效方剂，但其治疗银屑病的作用机制尚缺乏充分研究。本研究拟通过凉血解毒汤干预咪喹莫诱导的银屑病小鼠，检测小鼠皮损处的变化以及与CCL20/CCR6轴的关系，进而阐述凉血解毒汤对CCL20/CCR6轴变化的影响及其治疗银屑病的作用机制。

材料和方法

1 实验动物

BALB/c小鼠，雄性，体重18～20 g，SPF级，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证编号为SCXK(京)20090007。在三级动物室无菌饲料喂养。

2 主要试剂和药物

5%咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司出品)，CCL20单抗(Abcam)，凡士林(河北兰炼飞天石化有限公司产品)，超纯RNA提取试剂盒，HiFi－MMLV cDNA第1链合成试剂盒，UltraSYBR Mixture (With ROX)，DNase I，5×RNA Loading Buffer。凉血解毒汤来源于北京中医医院协定处方(土茯苓30 g、生槐花15 g、紫草10 g、草河车9 g、生地黄15 g、白鲜皮10 g、赤芍10 g、双花15 g、白茅根30 g、苦参10 g，各味中药饮片由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供)。

3 主要仪器

PCR仪、紫外分光光度计、凝胶电泳成像系统、高速冷冻离心机、超低温冰箱、脱水机、包埋机、石蜡切片机、图像分析系统等设备。

4 动物模型的建立与分组

24只小鼠编号称重后随机分为4组，每组6只，分别为空白对照(control)组:背部涂抹凡士林并灌胃蒸馏水(0.4 mL/d);银屑病模型(model)组:背部涂抹5%咪喹莫特乳膏25 mg并灌胃蒸馏水(0.4 mL/d);LXJD治疗组:背部涂抹5%咪喹莫特乳膏25 mg并灌胃凉血解毒汤(1 mg/kg，0.4 mL/d);CCL20单克隆抗体(阳性药)治疗组:背部涂抹5%咪喹莫特乳膏25 mg并背部注射CCL20单抗试液0.1 mL/ d。实验前用戊巴比妥钠按照80 mg/kg体重将小鼠进行腹腔麻醉，背部去毛后单笼饲养。中药组于造模次日起灌胃给药，模型组于造模次日起灌胃等量蒸馏水，每天2次，连续给药7 d，CCL20单克隆抗体治疗组背部注射CCL20抗体0.1 mL(浓度为30 mg/ L)。所有小鼠于造模第8天取背部皮损用于后续检测。

5 检测指标与方法

5.1 小鼠银屑病样皮损面积和疾病严重程度(psoriasis area and severity index，PASI)评分根据肉眼观察模型制备后各组小鼠皮损的变化情况，每天用相机记录变化情况。依据PASI评分标准给予小鼠相应红斑、鳞屑及浸润增厚程度的积分，将3者积分相加得到总积分，观察小鼠皮损的变化情况。

5.2 银屑病样小鼠组织学的观察于给药后第8天取小鼠背部皮损组织，10%甲醛固定，石蜡包埋切片。经HE染色观察创面的组织学变化，分析图像，绘制表示皮损增厚程度的柱状图。

5.3 小鼠银屑病皮损CCL20和CCR6 mRNA表达的检测采用real－time PCR法检测。用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA，用HiFi－MMLVcDNA第1链合成试剂盒进行反转录成cDNA，取5 μL cDNA用荧光染料UltraSYBR Mixture嵌合荧光法进行PCR扩增，以β－actin为内参照。扩增程序为:95°10 min;95℃15 s，60℃60 s，45个循环。扩增产物取5μL行1%琼脂糖凝胶电泳，选取样本cDNA进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参照基因引物进行扩增，同时在60～95℃进行融解曲线分析，结果显示各标准曲线的R2均达到0.99，说明线性相关度很高，且扩增效率均在90%以上。CCL20上游引物为5’－CAGCCAGGCAGA AGCAGCAA－3’，下游引物为5’－GGCCATCTGTCTTGTGAAACCCA－3’，产物大小100 bp;CCR6上游引物为5’－CCGTGTTGTATGCGTTTATTGGAC－3’，下游引物为5’－CCTTCTCATACACCACACATCCTTCA－3’，产物大小80－bp;β－actin上游引物为5’－GCCTTCCTTCTTGGGTA－3’，下游引物为5’－GGCATAGAGGTCTTTACGG－3’，产物大小97 bp，引物由北京金唯智生物科技有限公司合成，PCR采用ABI 7500型荧光定量PCR仪进行。采用2－ΔΔCt法进行数据的相对定量分析凉血解毒汤对小鼠银屑病皮损CCL20/CCR6 mRNA表达的影响。

6 统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，使用SPSS 15.0软件对数据进行分析，多组间均数比较采用单因素方差分析(one－way ANOVA)。PASI评分以中位数(下四分位数，上四分位数)［median(Q1，Q3)］表示，并采用秩和检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 凉血解毒汤对银屑病样小鼠皮损的影响

1.1 肉眼观察如图1所示，对照组小鼠背部皮肤光滑，无增厚，红斑以及脱屑。银屑病模型组小鼠咪喹莫特涂抹的第2天背部皮肤开始增厚，出现淡粉色红斑以及褶皱，第3天开始背部皮肤增厚程度加重，颈部皮肤开始出现少量银屑，此后皮肤持续增厚，红斑面积增大，鳞屑增多，至第8天开始背部皮肤显著增厚，皮肤出现大面积红斑并伴有大量脱屑。CCL20单克隆抗体治疗组小鼠第2天背部皮肤开始增厚，程度不及模型组，第3天开始背部皮肤出现明显红斑以及少量脱屑，程度不及银屑病模型组，至第8天开始小鼠皮肤增厚，少量红斑伴有脱屑，程度均不及银屑病模型组。LXJD治疗组小鼠第2天开始背部皮肤增厚，程度不及银屑病模型组，第3天开始背部皮肤出现红斑以及颈部皮肤出现脱屑，程度不及银屑病模型组。各小组PASI积分趋势见图2。

Figure 1.Effects of Liangxue－Jiedu(LXJD)prescription on mouse psoriasis－like skin lesions induced by imiquimod.图1 凉血解毒汤对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮损的影响

1.2 凉血解毒汤对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损组织学变化的影响如图3所示，在各组治疗的第8天，空白对照组小鼠皮肤表皮层薄，无明显分层，皮下淋巴细胞浸润较少。银屑病模型组小鼠皮肤表皮层显著增厚，厚度约为空白对照组的6～7倍左右，表皮出现明显分层，棘细胞层和颗粒层显著增厚，基底层细胞紧密排列，可见角化不全、Munro脓肿、鳞屑等，皮下大量淋巴细胞浸润。CCL20单克隆抗体治疗组小鼠皮肤表皮层厚度较空白对照组增厚，约为对照组2～3倍左右，而模型组厚度为其一半左右，棘细胞层和颗粒层分层不显著，厚度约为模型组一半，皮下淋巴细胞浸润较轻。LXJD治疗组小鼠皮肤表皮层增厚程度与阳性药物组相似，棘细胞层和颗粒层分层不显著，皮下淋巴细胞浸润较轻。

通过测量表皮垂直厚度发现，银屑病模型组增厚显著，约为对照组的6～7倍，LXJD治疗组以及CCL20单克隆抗体治疗组增厚程度不及模型组，与空白组相比，增厚程度约为3倍左右，与银屑病模型组相比增厚程度显著降低(P＜0.01)，与CCL20单克隆抗体治疗组相比无显著差异，见图4。

Figure 2.Effects of Liangxue－Jiedu(LXJD)prescription on PASI scores of mouse psoriasis－like skin lesions induced by imiquimod.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs model.图2 凉血解毒汤对银屑病样小鼠皮损PASI评分的影响

Figure 3.Effects of Liangxue－Jiedu(LXJD)prescription on histology changes of mouse psoriasis－like skin lesions induced by imiquimod(HE staining，×200).Δ indicates Munro microabscesses.图3 凉血解毒汤对银屑病样小鼠皮损病理学改变的影响

2 凉血解毒汤对银屑病样小鼠皮损CCL20和CCR6 mRNA表达的影响

与空白对照组小鼠皮肤组织相比，模型组小鼠皮损中CCL20 mRNA表达量显著升高(P＜0.05)，约为空白对照组的2倍，阳性药物组以及中药治疗组小鼠皮损中CCL20 mRNA表达量与空白对照组相比无明显差异;与模型组相比，中药治疗组以及阳性药组CCL20 mRNA均有所降低，约为模型组的60%～70%，差异有统计学意义(P＜0.05)，而中药组与阳性药组比较CCL20 mRNA表达差异不显著。与空白对照组小鼠皮肤组织相比，模型组小鼠皮损中CCR6 mRNA表达量升高不明显，而阳性药物组以及中药治疗组的小鼠皮损中CCR6 mRNA表达量与空白对照组相比有所降低，但差异无统计学意义，与模型组相比，中药治疗组以及阳性药组CCR6 mRNA均有所降低，约为模型组的一半，差异有统计学意义(P＜0.05)，而中药组与阳性药组比较CCR6 mRNA表达差异不显著，见图5。

讨论

银屑病是一种以T淋巴细胞活化和浸润为主要特征的慢性炎症反应性疾病，发病原因多样，涉及遗传、免疫、环境及精神等多种因素［2］。目前银屑病已经被定义为由Th17细胞介导的自身免疫性疾病，Th17细胞在IL－23的诱导下可以增殖、活化并分泌多种炎性细胞因子从而诱发银屑病等多种自身免疫性炎性损伤［4］。研究表明，银屑病患者皮损中有大量的Th17细胞浸润，血清中Th17细胞数量和Th17类细胞因子水平明显升高，且与病情严重程度相关［5］。有相关研究提示，Th17细胞向靶皮损的迁移及浸润是银屑病最早发生的生物学过程［6］。

表1 治疗第8天小鼠PASI评分Table 1.The PASI scores of mouse psoriasis－like skin lesin at day 8 of treatment(Mean±SD.n=6)

Figure 4.Comparison of epidermal thickness in skin lesions at day 8 of treatment.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs model.图4 治疗第8天垂直测量小鼠表皮厚度

Figure 5.CCL20/CCR6 mRNA expression in mouse psoriatic lesions at day 8 of treatment.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs model.图5 治疗第8天小鼠银屑病皮损CCL20/CCR6 mRNA表达的检测

趋化因子是一组具有趋化作用的细胞因子，能吸引免疫细胞到免疫应答局部，参与免疫调节和免疫病理反应。CCL20作为β趋化因子家族中的一员，主要由角质形成细胞分泌，具有趋化淋巴细胞的作用，对中性粒细胞几乎无趋化作用，在一般情况下，可以在外周血淋巴细胞、淋巴结、肝脏、阑尾以及肠道等组织中检测到其表达［7］。CCL20可以在皮肤组织中角质形成细胞、皮肤成纤维细胞、皮肤微血管内皮细胞以及树突状细胞中表达，多项研究已经证实，在正常皮肤中，角质形成细胞低水平表达CCL20，而在银屑病皮损中，CCL20在表皮基底层呈高度表达，与病损严重程度相关，并且受TNF－α、IL－1β、IL－17等炎症因子的影响。目前已经证实CCL20对树突状细胞和T细胞的定向迁移存在作用［8］。作为CCL20的唯一配体CCR6，主要表达于Th17上，而且CCR6的表达与IL－17的产生呈正相关［9］，相关研究提示趋化因子CCL20是通过与其唯一配体CCR6结合形成CCL20/CCR6轴而对靶细胞产生特异的趋化作用［10］。已有研究表明他汀类药物具有一定的抗炎作用，可以有效抑制炎症细胞的迁移浸润，Tae－Gyun等［11］通过体外培养HaTa细胞，在TNF－α、IL－17A的刺激下CCL20的表达显著增高，而给予氟伐他汀或辛伐他汀后，CCL20的表达显著下降，通过抑制CCL20/CCR6轴的作用从而下调了CD4+T细胞的迁移。多项研究表明，趋化因子通过免疫细胞异常迁徙介导自身免疫性疾病，而CCL20/CCR6轴可以通过趋化Th17细胞等免疫细胞参与银屑病的发病。本研究选取由咪喹莫特诱导形成的小鼠银屑病模型，同时选用CCL20单抗作为阳性药，比较治疗8 d后中药组以及阳性药物组小鼠与模型组小鼠皮损变化，研究凉血解毒汤是否通过对CCL20/CCR6轴产生影响从而对银屑病发病机制进行干预。

肉眼观察以及PASI评分结果显示，模型组小鼠皮损增厚显著，中药治疗组以及阳性药物组小鼠皮损相比较有所减轻，提示由咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠在给予阳性药CCL20抗体以及中药治疗8 d后可以显著改善银屑病样皮损。组织学染色结果显示模型组小鼠表皮层显著增厚，皮下大量淋巴细胞浸润，而中药治疗组以及阳性药物组小鼠皮肤表皮层厚度较模型组薄，皮下淋巴细胞浸润较轻，与肉眼大体观察结果一致。通过对小鼠银屑病皮损的CCL20/CCR6 mRNA表达进行检测，模型组皮损CCL20mRNA的表达较空白组增多，而CCL20单抗治疗组与LXJD治疗组比较模型组显著降低，而空白组与中药治疗组以及阳性药组相比较差异不显著，这一点与小鼠背部皮损的肉眼观测结果以及组织学比较相吻合，提示阳性药可以通过作用于表皮结合CCL20趋化因子从而减轻了银屑病样皮损，而中药治疗组小鼠皮损处CCL20 mRNA的表达也有所降低，由此可认为凉血解毒汤可以通过作用于CCL20趋化因子从而干扰了银屑病发病机制。而模型组皮损CCR6 mRNA相比较空白组增高不明显，但阳性药组以及中药治疗组CCR6 mRNA的表达与模型组比较显著降低，阳性药组与中药治疗组比较，结果差异不显著。而阳性药组和中药治疗组与空白组比较，CCR6 mRNA表达有所降低，但是降低程度不具有统计学意义。提示小鼠正常皮肤中也有CCL20、CCR6 mRNA表达，而银屑病样皮损中CCL20和CCR6 mRNA的表达上调，在给予阳性药治疗后小鼠银屑病样皮损减轻，而皮损中CCL20和CCR6的mRNA表达显著降低，中药治疗组与阳性药组结果一致，差异不显著，虽然对比空白组，模型组皮损CCR6 mRNA的表达增高不明显，原因尚有待进一步的研究。已有研究表明CCL20/CCR6轴参与了银屑病发病过程，而本研究可以肯定凉血解毒汤是通过作用于CCL20/CCR6轴从而减轻银屑病皮损，对银屑病发病环节进行干预。此项研究为临床使用凉血解毒方治疗银屑病提供一定的理论依据，而在今后治疗银屑病过程中其干预银屑病的作用靶点及思路仍是我们今后继续研究的方向及重点。

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Effects of LXJD prescription，a Chinese medicine，on CCL20 and CCR6 expression in mouse skin with psoriasis

WANG Ying1，2，DI Ting－ting2，RUAN Zhi－tong1，2，ZHAO Jing－xia2，LI Ping1，2

(1Beijing Chinese Medicine Hospital Affiliated to Capital Medical University，2Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100010，China.E-mail:liping411@yahoo.com.cn)

AIM:To observe the effects of Liangxue－Jiedu(LXJD)prescription，a Chinese medicine，on the expression of CC chemokine ligand 20(CCL20)and CC chemokine receptor 6(CCR6)in imiquimod－induced psoriasislike skin lesions in a mouse model.METHODS:Male BALB/c mice were randomly divided into control group，model group，LXJD treatment group and chemokine CCL20 monoclonal antibody treatment group.The mouse model of psoriasis was induced by imiquimod.The severity of psoriasis was assessed by the dermatologists using psoriasis area and severity index(PASI).The morphological changes of the skin tissues were observed under light microscope.The thickness of epidermis was measured.Real－time PCR was used to detect the expression of CCL20 and CCR6 in the skin tissue samples.RESULTS:The skin in model group showed a large number of scales，erythema and skin thickening.Compared with model group，the skin lesion in LXJD treatment group was attenuated.The erythema and scales were alleviated，the PASI score was reduced，and the expression of CCL20 and CCR6 was significantly lower than that in model group.CONCLUSION:LXJD prescription down－regulates the expression of CCL20/CCR6，thus attenuating the psoriasis skin lesions in mice.

Psoriasis;CC chemokine ligand 20;CC chemokine receptor 6;Liangxue－Jiedu prescription

R758.63;R28

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.025

1000－4718(2015)02－331－06

2014－09－12

2014－10－27

国家自然科学基金资助项目(No.81302985)

△通讯作者Tel:010－52176679;E－mail:liping411@yahoo.com.cn