槲皮素抑制异烟肼诱导的L-02细胞线粒体氧化应激性DNA损伤*

卢春凤，王淑秋，陈廷玉，张明远，王淑湘，王建杰，袁庆

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

槲皮素抑制异烟肼诱导的L-02细胞线粒体氧化应激性DNA损伤*

卢春凤，王淑秋△，陈廷玉，张明远，王淑湘，王建杰，袁庆

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的:探讨活性氧(ROS)介导的线粒体氧化损伤在异烟肼(INH)诱导L－02细胞DNA损伤中的作用及槲皮素对细胞的保护作用。方法:建立体外培养INH致肝细胞L－02损伤的模型，将细胞分为对照(control)组、INH组、槲皮素低剂量(Que low)及高剂量(Que high)组。利用彗星试验评价细胞DNA损伤;制备L－02细胞线粒体，应用荧光探针DCFH－DA和rhodamine 123检测细胞线粒体ROS水平及线粒体膜电位(ΔΨm);采用TBA法测定丙二醛(MDA)含量;应用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性;采用Western blotting法检测细胞中Bcl－2和Bax蛋白表达，计算Bax/Bcl－2值。结果:INH可诱导L－02细胞DNA损伤，使细胞线粒体ROS水平、细胞MDA含量及Bax/Bcl－2值明显增高，并使细胞ΔΨm值和SOD活性明显下降。而槲皮素能减轻细胞DNA损伤，减少细胞ROS水平，增加细胞ΔΨm值，降低细胞MDA含量，增加SOD活性，减少Bax/Bcl－2值。结论:INH可通过诱导细胞线粒体氧化应激导致L－02细胞DNA损伤。槲皮素能减轻INH诱导L－02细胞的DNA损伤，对L－02细胞具有保护作用，可能与其抑制ROS介导的线粒体氧化损伤有关。

槲皮素;异烟肼;线粒体氧化损伤;L－02细胞;DNA损伤

氧化应激是许多药物引起肝脏毒性的主要机制，线粒体是细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生的主要场所，也是氧化损伤的主要靶点［1］。异烟肼(isonicotinyl hydrazide，INH)有很多不良反应，最严重的是肝脏损伤，但到目前为止其肝脏毒性的具体机制尚未阐明［2］。槲皮素(quercetin，Que)属类黄酮物质，广泛存在于水果、蔬菜和一些中草药中，是具有临床应用前景的抗氧化剂。因此，本实验以体外培养的人肝细胞L－02为研究对象，利用差速离心法制备细胞线粒体，在亚细胞水平上研究ROS介导的线粒体氧化损伤在INH诱导L－02细胞DNA损伤中的作用，进一步探讨INH的肝细胞毒性机制及槲皮素的保护效应和机制，以期为临床防治INH的肝脏毒性提供一定的实验依据。

材料和方法

1 细胞和主要试剂

正常人肝细胞L－02购自中国科学院上海细胞库;胎牛血清为HyClone产品;DMEM培养基为Gibco产品;槲皮素、异烟肼(INH)、DCFH－DA和rhodamine 123均为Sigma产品;正常熔点琼脂糖和低熔点琼脂糖均为Amresco产品;丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为Merck产品;兔抗Bcl－2和Bax多克隆抗体为Santa Cruz产品;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 细胞培养及处理用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养L－02细胞，镜下观察细胞生长情况，取生长状态良好的细胞进行试验。将细胞分为4组:对照组(加入与处理组相同体积的无血清培养基);INH(10 mmol/L)组;槲皮素低剂量(25 μmol/L)组;槲皮素高剂量(50 μmol/L)组。

2.2 指标检测按上述分组将L－02细胞处理24 h后，收集细胞，利用彗星试验评价细胞DNA损伤情况，用CASP彗星分析软件进行图像分析，分析指标包括DNA的尾长(tail length)、尾部DNA(tail DNA)百分含量和尾矩(tail moment)。差速离心法制备L－02细胞线粒体，应用荧光探针DCFH－DA和rhodamine 123检测细胞线粒体ROS水平及线粒体膜电位(ΔΨm);采用TBA法测定细胞内脂质过氧化产物MDA的含量;应用黄嘌呤氧化酶法评估细胞内抗氧化酶SOD的活性;采用Western blotting法检测细胞中凋亡调控蛋白Bcl－2和Bax表达，并计算Bax/Bcl－2值。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示。应用SPSS 11.0软件进行统计分析，并用Origin 7.5作图。组间均数比较采用单因素方差进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 槲皮素和INH对细胞DNA损伤的影响

槲皮素和INH处理L－02细胞24 h后，进行单细胞凝胶电泳，然后在荧光显微镜下观察细胞DNA损伤情况:正常组细胞的DNA大部分呈圆形荧光团，无拖尾现象;INH组的细胞DNA有拖尾现象，呈现不同程度的头尾分明的典型彗星图像;槲皮素组的细胞DNA拖尾现象明显减轻，高剂量组的效果更明显。应用CASP彗星分析软件进行图像分析发现，与对照组相比，INH组细胞DNA的尾长、尾部DNA百分含量和尾矩均显著增加(P＜0.01)，表明INH诱导了细胞DNA损伤;槲皮素组细胞DNA的尾长、尾部DNA百分含量和尾矩均明显减少，与INH组相比差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，表明槲皮素减轻了INH对细胞DNA的损伤，对L－02细胞有保护作用，且高剂量组的保护作用更显著，见图1～3。

Figure 1.The effects of quercetin and INH on tail length of DNA in L－02 cells.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.图1 槲皮素和INH对L-02细胞DNA尾长的影响

Figure 2.The effects of quercetin and INH on tail DNA of DNA in L－02 cells.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.图2 槲皮素和INH对L-02细胞尾部DNA百分含量的影响

Figure 3.The effects of quercetin and INH on tail moment of DNA in L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.图3 槲皮素和INH对L-02细胞DNA尾矩的影响

2 槲皮素和INH对细胞线粒体ROS生成的影响

由图4可见，经INH处理L－02细胞后，与对照组相比，细胞线粒体的ROS水平显著增高(P＜0.01)，表明INH可诱导细胞线粒体ROS的生成;槲皮素组的细胞线粒体ROS水平均明显降低，与INH组相比，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，表明槲皮素可抑制细胞线粒体ROS的生成，且高剂量组抑制细胞线粒体ROS生成的作用更显著。

Figure 4.The effects of quercetin and INH on the mitochondrial ROS generation in L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.图4 槲皮素和INH对L-02细胞线粒体ROS生成的影响

3 槲皮素和INH对线粒体膜电位的影响

由图5可见，经INH处理L－02细胞后，与对照组相比，细胞ΔΨm值显著下降(P＜0.01)，表明INH可造成细胞线粒体损伤;槲皮素组的细胞ΔΨm值均明显增高，与INH组相比，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，表明槲皮素对细胞线粒体有保护作用，且高剂量组对细胞线粒体的保护作用更明显。

Figure 5.The effects of quercetin and INH on ΔΨmin L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.图5 槲皮素和INH对L-02细胞线粒体膜电位的影响

4 槲皮素和INH对细胞丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的影响

由图6可见，经INH处理L－02细胞后，与对照组相比，细胞的MDA含量明显增加(P＜0.01)，表明INH可使细胞发生脂质过氧化反应;槲皮素组细胞的MDA含量均明显减少，与INH组相比，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，表明槲皮素有抗脂质过氧化作用，且高剂量组的作用更显著。

Figure 6.The effects of quercetin and INH on the content of MDA in L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.图6 槲皮素和INH对L-02细胞MDA含量的影响

5 槲皮素和INH对细胞SOD活性的影响

由图7可见，经INH处理L－02细胞后，与对照组相比，细胞的SOD活性显著降低(P＜0.01)，表明INH可降低细胞的抗氧化能力;槲皮素组细胞的SOD活性均明显增高，与INH组相比，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，表明槲皮素增加细胞的抗氧化能力，且高剂量组的作用更显著。

Figure 7.The effects of quercetin and INH on the activity of SOD in L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.图7 槲皮素和INH对L-02细胞SOD活性的影响

6 槲皮素和INH对细胞凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax表达的影响

经INH处理L－02细胞后，与对照组相比，细胞的Bcl－2蛋白表达明显减少，而Bax蛋白表达明显增加，Bax/Bcl－2值显著增高(P＜0.01);槲皮素高剂量组细胞Bcl－2蛋白表达明显增多，而Bax蛋白表达明显减少，Bax/Bcl－2值明显降低，与INH组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图8。

Figure 8.The effects of quercetin and INH on the ratio of Bax/ Bcl－2 in L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs INH group.图8 槲皮素和INH对L-02细胞Bax/Bcl-2值的影响

讨论

正常情况下，细胞内氧自由基的产生与清除处于动态平衡状态，当细胞内ROS等自由基生成增加和/或抗氧化系统的清除能力降低，细胞将会发生氧化应激反应，引起细胞内大分子物质发生氧化损伤，从而造成细胞损伤［3］。线粒体是细胞产生ROS的主要场所，也是多数有毒化合物攻击的主要靶点。研究表明，ROS过多生成可损伤线粒体膜，导致ΔΨm值下降［4－5］。

为了观察INH是否能诱导L－02细胞DNA损伤，进而研究槲皮素的作用及机制，我们利用彗星试验评价了细胞DNA损伤情况，评价指标包括细胞DNA的尾长、尾部DNA百分含量和尾矩，其中，尾长是指DNA从细胞中心迁移的距离，在低损伤剂量范围内与DNA损伤呈线性关系;尾部DNA百分含量反映细胞拖尾中DNA碎片的多少，尾部DNA百分含量与损伤程度有关;尾矩是指从彗星头部的右边界到彗星尾部末端的距离与尾部DNA百分含量的乘积，也与损伤程度呈线性关系。实验结果显示，INH能诱导L－02细胞DNA损伤，而槲皮素对受损伤细胞有保护作用。那么INH诱导L－02细胞DNA损伤是否与ROS及线粒体损伤有关?因此，本实验检测了细胞线粒体ROS水平及ΔΨm值。ROS是细胞内主要的氧自由基，它的水平能反映细胞内氧化系统的情况;ΔΨm值是反映线粒体功能的关键指标，ΔΨm值降低提示细胞发生线粒体损伤［6］。L－02细胞经INH处理后，细胞线粒体ROS生成显著增多，ΔΨm值明显下降;而槲皮素能明显减少细胞线粒体ROS生成，并增加细胞ΔΨm值，提示INH能促进细胞线粒体ROS生成，导致细胞线粒体损伤;槲皮素能减轻INH诱导的细胞线粒体损伤。

INH能造成细胞线粒体损伤，那么INH诱导L－02细胞DNA损伤是否与ROS介导的氧化损伤有关?因此，本实验进一步检测了氧化损伤的重要指标MDA和SOD。MDA是典型的脂质过氧化产物，其含量的多少可反映细胞发生脂质过氧化的程度，间接反映细胞发生氧化损伤的程度;SOD能清除自由基，是细胞内重要的抗氧化物酶，其活性的高低可反映细胞的抗氧化能力［7］。研究表明，槲皮素在体外可通过与金属离子结合、清除ROS等自由基及抑制DNA损伤等发挥抗氧化作用［8－10］。此外，体内实验已证实槲皮素可通过降低脂质过氧化物水平、增加抗氧化系统的能力对氧化损伤的肝脏发挥保护效应［11］。实验结果发现，L－02细胞经INH处理后，细胞中MDA含量显著增高，而SOD的活性显著降低，表明在本实验条件下INH可诱导L－02细胞发生氧化损伤。这提示INH进入细胞内，可能诱导细胞线粒体大量生成ROS，降低细胞SOD活性，使细胞内氧化与抗氧化系统失衡，导致线粒体损伤，进而诱发氧化应激反应，使线粒体受损，引起ΔΨm值下降，氧化产物MDA含量增加，DNA链断裂，造成细胞损伤及细胞凋亡［12］。实验还发现，槲皮素能减少细胞MDA含量，增加SOD的活性，表明槲皮素能减轻INH诱导的L－02细胞氧化损伤，可能是通过清除细胞线粒体ROS，提高细胞内抗氧化系统的能力，抑制线粒体氧化应激反应，从而发挥其作用。

此外，本实验还检测了Bcl－2和Bax蛋白表达，并计算Bax/Bcl－2值。Bcl－2和Bax是调控细胞凋亡重要蛋白，Bax是促凋亡蛋白，而Bcl－2是抑凋亡蛋白［13］，一般认为Bax和Bcl－2的比值是决定细胞是否发生凋亡的关键因素。研究表明，细胞ΔΨm值下降可促进Bax由细胞浆转位至线粒体膜，进而启动线粒体凋亡途径，激活caspase蛋白酶家族，使DNA降解，造成DNA损伤［14－15］。实验结果发现，INH能下调细胞Bcl－2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，增加Bax/Bcl－2值，表明INH可诱导细胞凋亡;高剂量槲皮素能上调细胞Bcl－2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，使Bax/Bcl－2值降低，表明槲皮素可通过调整Bax和Bcl－2的比例发挥其抗凋亡的作用，进而保护细胞免受损伤。

综上所述，在本实验条件下，INH能诱导L－02细胞DNA损伤，ROS介导的细胞线粒体氧化损伤在此过程中发挥了重要作用。槲皮素能减轻INH诱导L－02细胞的DNA损伤效应，对L－02细胞具有保护作用，可能与其抑制ROS介导的线粒体氧化损伤有关。

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Protective effect of quercetin on L-02 cells by inhibiting DNA damage of INH-induced mitochondrial oxidative stress

LU Chun－feng，WANG Shu－qiu，CHEN Ting－yu，ZHANG Ming－yuan，WANG Shu－xiang，WANG Jian－jie，YUAN Qing

(Basic Medical College，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China.E-mail:wang_shuq@163.com)

AIM:To investigate the role of reactive oxygen species(ROS)－mediated mitochondrial oxidative injury in isonicotinyl hydrazide(INH)－induced DNA damage and the protective effect of quercetin on L－02 cells.METHODS:The injury model of hepatocyte L－02cells in vitro induced by INH was established.The cells were divided into control group，INH group，low－dose quercetin group and high－dose quercetin group.The DNA damage of L－02 cells was evaluated by the comet test.The mitochondrion was prepared，and the level of mitochondrial ROS and the value of mitochondrial membrane potential(ΔΨm)were detected by fluorescent probes DCFH－DA and rhodamine 123.The content of MDA was measured by TBA method.The activity of SOD was assessed with the xanthine oxidase method.The protein expression of Bcl－2 and Bax was determined by Western blotting，and the value of Bax/Bcl－2 was calculated.RESULTS:INH induced obvious DNA damage，increased the level of mitochondrial ROS，the content of MDA and the value of Bax/ Bcl－2，and markedly reduced the value of ΔΨmand the activity of SOD in the L－02 cells.Quercetin attenuated DNA damage，reduced the level of mitochondrial ROS，elevated the value of ΔΨm，declined the content of MDA，increased the activity of SOD and decreased the value of Bax/Bcl－2 in the L－02 cells.CONCLUSION:INH induces DNA damage in L－02 cells by generation of mitochondrial oxidative stress.Quercetin has a protective effect on L－02 cells to attenuate the INH－induced DNA damage by inhibiting ROS－mediated mitochondrial oxidative damage.

Quercetin;Isoniazid;Mitochondrial oxidative damage;L－02 cells;DNA damage

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.021

1000－4718(2015)02－308－05

2014－09－03

2014－10－23

国家自然科学基金资助项目(No.81373497);黑龙江省自然科学基金资助项目(No.D201248);佳木斯大学科学技术研究项目(No.Sjz2012－09)

△通讯作者Tel:0454－8618518;E－mail:wang_shuq@163.com