告达庭增强TRAIL诱导的HepG2细胞凋亡*

费洪荣，王桂玲，赵莹，周洪雷

(1山东中医药大学药学院，山东 济南 250355;2泰山医学院药学院，药物化学山东省医药卫生重点学科，山东 泰安 271016)

告达庭增强TRAIL诱导的HepG2细胞凋亡*

费洪荣1，2，王桂玲2，赵莹2，周洪雷1△

(1山东中医药大学药学院，山东 济南 250355;2泰山医学院药学院，药物化学山东省医药卫生重点学科，山东 泰安 271016)

目的:研究C21甾体苷元告达庭对肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的HepG2肝癌细胞增殖和凋亡的影响，并进一步明确其作用机制。方法:采用MTT法和细胞集落形成实验检测告达庭与TRAIL联合对细胞增殖的影响;TUNEL染色法检测细胞凋亡的变化;免疫印迹实验分析蛋白的表达水平。结果:告达庭与TRAIL联合作用HepG2细胞24 h后，细胞活力明显下降，细胞增殖受到抑制;同时，两者联用后细胞凋亡数目明显增加，显著高于告达庭和TRAIL单用诱导的细胞凋亡率;与对照相比，告达庭与TRAIL联用促进了caspase－3、caspase－7、caspase－9和PARP的活性切割，而凋亡抑制蛋白survivin的表达则下调。结论:告达庭能够增强TRAIL诱导HepG2细胞凋亡，其机制可能与激活caspase家族因子的活性切割和抑制survivin的表达相关。

告达庭;肿瘤坏死因子凋亡诱导配体;癌，肝细胞;细胞凋亡;Caspases

肝细胞癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，国内外临床主要采取手术切除辅以化学药物治疗的方案。联合化学药物治疗对提高临床疗效，延长患者生存时间有重要意义。近年来，肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand，TRAIL)介导的细胞凋亡疗法在肿瘤的临床治疗中表现出良好的应用前景。TRAIL是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族中的一个新型凋亡分子，可选择性诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，而不影响正常细胞的生存［1－2］。然而，研究发现许多肿瘤细胞对TRAIL表现出较高的耐受性。因此，探索逆转TRAIL耐药的机制与方案，对增强TRAIL的生物活性及其临床应用具有重要价值［3］。

告达庭(caudatin)是从萝藦科植物耳叶牛皮消(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)或戟叶牛皮消(Cynanchum bungei Decne)的干燥根茎(白首乌)中分离得到的一种C21甾体苷元。我们前期研究发现告达庭在多种肿瘤细胞中表现出较强的抑癌活性，能够通过阻滞细胞周期的进程来抑制肿瘤细胞增殖;通过激活线粒体凋亡途径诱导肿瘤细胞发生凋亡;同时对肿瘤细胞的迁移和血管生成也表现出显著的抑制作用［4－6］。本研究以人肝癌HepG2细胞为实验材料，观察告达庭联合TRAIL对肝癌细胞增殖与凋亡的影响，并阐明其内在的分子机理，以期为肝细胞癌的临床治疗提供有效的用药参考。

材料和方法

1 材料

HepG2细胞(中国科学院上海细胞库);重组人TRAIL/Apo2(PeproTech);MTT(Sigma);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Roche);ECL Western blotting显色试剂盒(Pierce);pro－caspase－3、pro－caspase－7、procaspase－9、survivin和聚(ADP－核糖)聚合酶［poly (ADP－ribose)polymerase，PARP］抗体(Cell Signaling);β－actin抗体(Sigma);DMEM培养基和胎牛血清(Gibco);II抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);告达庭(自制，纯度98.2%)［7］。

2 方法

2.1 细胞培养HepG2细胞采用DMEM高糖培养液，含10%胎牛血清，于37℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2 MTT法测定细胞活力胰酶消化细胞并接种于96孔细胞培养板，培养24 h，加入50 μmol/L告达庭，100 μg/L TRAIL以及两者合用处理HepG2细胞后继续培养，对照组加入DMSO。终止培养前4 h加20 μL(5 g/L)的MTT于各个孔中，然后吸去孔中的培养液，接着加入150 μL的DMSO并振荡10 min;490 nm波长下测定各孔的A值，以同样的方法测6个平行孔，对结果进行统计分析，实验重复3次。

2.3 细胞集落形成实验细胞以每孔5×103个接种于6孔板中，继续培养24 h后加入40 μmol/L告达庭，100 μg/L TRAIL以及两者合用处理HepG2细胞。置CO2培养箱中继续培养10 d后，去除培养基，甲醇固定10 min，台盼蓝染色20 min，镜下观察并计数细胞集落形成数(＞30个细胞)。实验重复3次。

2.4 TUNEL法检测细胞凋亡细胞经药物作用24 h后，PBS洗涤细胞3次，接着4℃固定细胞1 h，0.1%Triton X－100打孔2 min。然后按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书对细胞进行凋亡染色，倒置荧光显微镜观察细胞的TUNEL染色结果，并对结果进行统计分析。

2.5 免疫印迹分析细胞用预冷PBS洗2次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液冰上放置15～20 min，4℃13 000×g离心20 min，收集上清用于蛋白定量。取30 μg总蛋白进行SDS－PAGE分离蛋白，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h;然后加入I抗，室温孵育3 h;加入II抗，室温孵育2 h;最后PBST洗膜，ECL显色试剂盒于暗室曝光显影。实验重复3次。

3 统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 告达庭联合TRAIL对HepG2细胞增殖的抑制作用

MTT结果表明，50 μmol/L告达庭与TRAIL(100 μg/L)合用后，HepG2细胞活力明显受到抑制，见图1，差异有统计学意义(P＜0.05)。同时，细胞集落形成实验结果显示，40 μmol/L告达庭和100 μg/L TRAIL联合应用明显抑制了HepG2细胞的增殖，见图2。

Figure 1.Caudatin enhanced TRAIL－induced cytotoxicity in the HepG2 cells.The cells were co－treated with 50 μmol/ L caudatin and 100 μg/L TRAIL for 24 h，and the cell viability was determined by MTT assay.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs caudatin group.图1 告达庭增强TRAIL对HepG2细胞活力的抑制作用

2 告达庭与TRAIL联用促进HepG2细胞的凋亡

脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测了告达庭与TRAIL合用对HepG2细胞凋亡的影响。从图3可以看出，50 μmol/L告达庭与100 μg/L TRAIL联用24 h后，与对照组及单独用药组相比，HepG2细胞的凋亡数目明显增加。

Figure 2.Combination of caudatin(40 μmol/L)with TRAIL(100 μg/L)inhibited the colony formation ability of HepG2 cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs caudatin group.图2 告达庭与TRAIL联用抑制HepG2细胞集落的形成

Figure 3.The HepG2 cells were treated with TRAIL(100 μg/ L)alone or together with caudatin(50 μmol/L)for 24 h.After treatment，the apoptosis was detected by TUNEL assay.The number of apoptotic cells was expressed as percentage of total cell number.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs caudatin group.图3 TUNEL染色法检测细胞的凋亡

3 告达庭与TRAIL合用对凋亡相关蛋白的影响

为了进一步确定联合用药对于HepG2细胞凋亡的协同作用并探讨可能的机制，免疫印迹实验检测了与细胞凋亡密切相关的caspase－3、caspase－7、caspase－9和PARP的表达。与单独处理组相比，告达庭和TRAIL联合组caspase－3、caspase－7和caspase－9活性切割体明显增加，同时PARP的剪切片段明显增多，见图4。

4 告达庭与TRAIL合用抑制survivin的表达

由于细胞凋亡通路的重要抑制因子survivin的表达与肿瘤细胞的TRAIL耐受性关系密切［8］，本研究最后检测告达庭和TRAIL联用对survivin蛋白表达的影响。免疫印迹结果表明，告达庭和TRAIL联用协同抑制了survivin的表达，见图5。

讨论

泰山白首乌为萝摩科鹅绒藤属植物戟叶牛皮消的干燥块根，富含多糖类、C21甾体类以及卵磷脂类等活性成分，具有补血益精、延年益寿等功效，其醇提物能够抑制肝癌细胞增殖［9］。从白首乌中分离的C21甾体苷元告达庭具有良好抗癌活性，可通过调控wnt/β－catenin信号通路来抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤效果［4］。本研究发现告达庭可增强肝癌细胞HepG2对靶向生物制剂TRAIL的敏感性。MTT和细胞集落形成实验结果显示，告达庭与TRAIL合用显著抑制HepG2细胞的增殖，TUNEL染色证实两者联用可协同诱导细胞凋亡。同时，凋亡相关的caspase－3、caspase－7、caspase－9和PARP的切割体增加。另外，凋亡抑制蛋白survivin的表达也受到抑制。

作为TNF家族的关键成员之一，TRAIL能特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性，因此在肿瘤治疗上具有广阔的前景。与TNF超家族其它成员一样，TRAIL以同源3聚体作为活性单位，与细胞表面特异性死亡受体(death receptor，DR)结合而发挥功能。目前被鉴定出来的死亡受体主要包括TRAILR1(DR4)和死亡受体TRAILR2(DR5)［10］。TRAIL能够分别与DR4和DR5受体结合，然后募集接头分子FADD(Fas－associated death domain protein)，与细胞内的胱天蛋白酶原结合，形成死亡诱导信号复合物，最后将活化信号传递并激活caspase－3，从而发挥诱导细胞凋亡的生物学功能［11－12］。然而有研究表明，包括HepG2肝癌细胞在内的一些肿瘤细胞对TRAIL存在耐受性，因此如何增加TRAIL对肿瘤细胞敏感性已经成为其研究重点之一。本研究将中药提取物告达庭和TRAIL有效结合，体外检测两者联用对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。结果表明，告达庭与TRAIL联用能够有效抑制HepG2细胞增殖并诱导其发生凋亡，其机制与激活caspase家族因子的活性切割和下调survivin的表达相关。

Figure 4.The effect of combination of caudatin with TRAIL on the expression of caspase－3，caspase－7，caspase－9 and PARP in the HepG2 cells.The HepG2 cells were exposed to TRAIL with or without caudatin for 24 h.Whole－cell extracts were prepared and analyzed by Western blotting.β－actin was served as a loading control.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs caudatin group.图4 告达庭与TRAIL联用对细胞凋亡相关蛋白表达的影响

Figure 5.The survivin levels in HepG2 cells determined by Western blotting.β－actin was used as an internal standard.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs caudatin group.图5 免疫印迹法检测HepG2细胞内survivin的表达水平

Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族重要一员，也是一种肿瘤特异性凋亡抑制因子，其表达水平的异常增高与许多肿瘤的发生发展密切相关，因此被认为是特异性靶向肿瘤治疗的理想靶点［13］。在抑制细胞凋亡的过程中，survivin能够分别通过死亡受体途径和线粒体途径，将抗凋亡信号传递给caspase－3和caspase－7，从而抑制细胞凋亡［14］。除了参与对细胞凋亡的抑制作用，survivin与肿瘤的放化疗敏感性也关系密切［15］。本研究发现，告达庭与TRAIL联用显著下调survivin表达，可能与两者协同抑制肝细胞癌的活性相关。

总之，本研究表明告达庭能够促进TRAIL诱导HepG2肝癌细胞的凋亡，这为今后两者的联合应用治疗肝细胞癌提供了实验依据，也为综合开发C21甾体苷类化合物的临床用药拓宽了思路。告达庭和TRAIL均表现出广谱抗肿瘤能力，后续的研究工作在阐明告达庭增强TRAIL抑癌分子机制的同时，开展体内动物实验研究，为将TRAIL用于临床肿瘤治疗提供更多的实验依据。

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Caudatin sensitizes TRAIL-induced HepG2 cell apoptosis

FEI Hong－rong1，2，WANG Gui－ling2，ZHAO Ying2，ZHOU Hong－lei1

(1School of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China;2School of Pharmacy，Taishan Medical University，Medicinal Chemistry，Medicine and Health Key Discipline in Shandong Province，Taian 271016，China.E-mail:zhouhongleitcm@163.com)

AIM:To determine whether caudatin，a C21steroidal aglycone，enhances tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand(TRAIL)－associated HepG2 cell apoptosis.METHODS:Cell growth inhibition was determined by MTT assay and cell colony formation assay.The TUNEL apoptosis detection kit was used to analyze cell apoptosis，and the protein expression was examined by Western blotting.RESULTS:Combination of caudatin with TRAIL significantly reduced cell proliferation and increased the apoptotic rate of HepG2 cells compared with the use of each agent alone.This was evidenced by marked increases in caspase－3，caspase－7，caspase－9 and PARP cleavages in the cells treated with caudatin and TRAIL－compared with control group.Combination of caudatin with TRAIL also led to the strong suppression of survivin.CONCLUSION:Caudatin synergizes HepG2 cells to TRAIL－induced apoptosis by promoting the cleavages of caspase－3，caspase－7，caspase－9 and PARP and inhibiting the expression of survivin.

Caudatin;Tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand;Carcinoma，hepatocellular; Apoptosis;Caspases

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.016

1000－4718(2015)02－279－05

2014－09－29

2014－11－03

国家自然科学基金资助项目(No.81272683);山东省自然科学基金资助项目(No.ZR2011HQ034)

△通讯作者Tel:0531－89628065;E－mail:zhouhongleitcm@163.com