通心络对心肌梗死大鼠心室缝隙连接蛋白43重构及室性心律失常的影响*

李华波，陈世健，胡建华，汪莲开

(湖北民族学院附属民大医院心内科，湖北 恩施 445000)

通心络对心肌梗死大鼠心室缝隙连接蛋白43重构及室性心律失常的影响*

李华波，陈世健，胡建华，汪莲开△

(湖北民族学院附属民大医院心内科，湖北 恩施 445000)

目的:探讨通心络(TXL)对心肌梗死大鼠心室缝隙连接蛋白43(Cx43)重构及室性心律失常(VA)的影响。方法:雄性SD大鼠100只，随机分为假手术(sham)组(n=25)和手术组(n=75)。手术组动物结扎冠状动脉左前降支制备心肌梗死模型，假手术组只开胸不结扎。将手术后存活3 d的大鼠随机分为TXL治疗组(TXL组)和心肌梗死组(MI组)。TXL组给予TXL(2 g·kg－1·d－1)连续4周灌胃治疗，MI组和sham组则给予等体积生理盐水灌胃。药物干预结束后，采用酶联免疫吸附法检测梗死周边区心肌组织白细胞介素－1β(IL－1β)及内皮素－1 (ET－1)的水平;免疫组化法检测Cx43的分布;Western blotting法检测Cx43表达;RT－PCR法检测Cx43 mRNA的表达;采用Burst刺激诱发VA。结果:与sham组相比，MI组梗死周边心肌的IL－1β和ET－1水平均显著升高，而Cx43的mRNA及蛋白表达均显著降低，Cx43分布无规律性且侧面化分布增多，VA诱发率也明显升高(P＜0.05);与MI组相比，TXL组梗死周边心肌IL－1β和ET－1水平明显降低，Cx43的mRNA及蛋白表达均显著增加，Cx43部分呈线性分布于心肌细胞闰盘处，VA诱发率也明显降低(P＜0.05)。结论:TXL可降低心肌梗死大鼠VA的发生率，其机制可能与TXL抑制心肌梗死后Cx43重构有关。

心肌梗死;通心络;缝隙连接蛋白43;室性心律失常

缝隙连接蛋白43(connexin 43，Cx43)是一种沟通相邻细胞胞质的连接通道，它广泛分布于心肌组织，为心肌细胞间提供了低电阻的信号传导途径。一些研究结果显示心肌梗死(myocardial infarction，MI)后存在Cx43重构的现象，具体表现为梗死心肌Cx43表达下降及侧面化分布增多［1－2］。这些研究还表明Cx43的这种重构可能与心肌梗死后室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)及猝死的发生有关。通心络(tongxinluo，TXL)是祖国医学中依据络病学理论研制而成的一种复方制剂，既往细胞水平研究发现TXL可抑制异丙肾上腺素引起的心肌细胞Cx43 mRNA表达下调［3］，由此提示我们，TXL可能具有改善心肌梗死后Cx43重构的作用，从而降低心肌梗死后VA的发生率。本研究通过给予心肌梗死大鼠TXL干预，探讨用TXL治疗对大鼠心肌梗死后Cx43重构及VA诱发率的影响。

材料和方法

1 动物分组、模型制备及药物干预

实验用雄性SD大鼠100只，体重200～250 g，由武汉大学医学部实验动物中心提供。随机将动物分为假手术(sham)组(n=25)和手术组(n=75)。手术组动物给予3%苯巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，10 min后自左侧3～4肋间开胸，暴露心脏，采用冠状动脉左前降支结扎的方法制备心肌梗死模型。术中心电监护，以心电图II导联ST段抬高和缺血区域心肌颜色改变作为造模成功的标志。心肌梗死造模后存活3 d大鼠共64只，随后被随机分成TXL治疗组(TXL组，n=32)和心肌梗死组(MI组，n =32)。假手术组动物采用相同的开胸方法，但是只剪开心包腔，不结扎冠状动脉。于造模后第4天，TXL组参照文献［4］给予TXL(2 g·kg－1·d－1)灌胃治疗连续4周，而MI组和sham组则给予等体积生理盐水连续灌胃4周。

2 实验方法

2.1 心肌组织白细胞介素－1β(interleukin－1β，IL－1β)及内皮素－1(endothelin－1，ET－1)水平的检测

每组各选4只动物给予戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后处死，迅速取出心脏，取梗死周边区左室心肌组织100 mg，加入0.6 mL生理盐水，用组织匀浆机按10 000～15 000r/min上下研磨制成组织匀浆(匀浆时间10秒/次，间隙30 s，连续3～5次，在冰水中进行)，迅速匀浆后，以14 000 r/min在4℃下离心10 min，取上清存放于－80℃冰箱待用。测定前用生理盐水将上清液体积调为1 mL。采用酶联免疫吸附试验试剂盒测定心肌组织中的IL－1β及ET－1水平，ELISA试剂盒购自RD，操作过程严格按照试剂盒说明书完成。

2.2 RT－PCR检测Cx43 mRNA的表达量每组各选4只动物安乐死后迅速取出心脏，剪下梗死周边区左心室组织100 mg，加入1 mL预冷的Trizol在冰上充分研磨提取总RNA。根据Fermentas反转录试剂盒说明，将提取的总RNA反转录为cDNA，并置于－20oC冰箱保存备用。使用Primer 5.0设计引物并由Invitrogen公司合成。上游引物序列为5’－TGAAAGAGAGGTGCCCAGA－3’，下游引物序列为5’－CGTGAGAGATGGGGAAGGACT－3’。

2.3 Western blotting检测Cx43及磷酸化Cx43(p－Cx43)蛋白表达量每组各选4只动物安乐死后迅速取出心脏，剪下梗死边缘区左心室组织100 mg，将组织剪成细小的碎片，按每20 mg组织加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃12 000×g离心15 min，取上清，进行蛋白质定量后贮存于－80℃冰箱。利用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后将蛋白转移至PVDF膜上，置于5%脱脂奶粉中4℃过夜，分别加入1∶1 000稀释的I抗(Cx43多克隆抗体和p－Cx43多克隆抗体)和1∶1500的β－actin抗体，4℃孵育过夜。TBST洗涤3次后加入1∶1 500稀释的HRP标记的羊抗兔II抗(IgG)中室温下孵育1 h，然后TBST洗膜3次。将膜与ECL反应1～5 min后，曝光于感光胶片上，显影、定影。

2.4 在体VA的诱发将各组剩下的动物行在体电生理研究。以3%戊巴比妥钠溶液(60 mg/kg，Sigma)行腹腔注射麻醉，多导电生理记录仪记录大鼠的体表II导联心电图。将1对铂金刺激电极(两电极间距为1 mm)连接于LEAD2000B多道电生理仪(四川锦江通用实业有限公司)，动物开胸后，将刺激电极置于右室流出道行Burst刺激(给予50 Hz持续时间2 s的Train刺激，总刺激时间小于2 min)诱发VA。VA持续时间超过2 s即记为VA可诱发，超过30 s即记为持续性室性心律失常(SVA)［5］。

2.5 免疫组化分析Cx43的分布在体电生理研究结束后，每组各选5个心脏行免疫组化分析Cx43的分布情况。取梗死周边区心肌组织标本，常规石蜡包埋切片，片厚4～5 μm，每个心脏做3张切片。组织切片加入I抗Cx43单克隆抗体(1∶200，Chemicon)后置于4°C湿盒中孵育过夜;第2天用PBS冲洗切片3次，每次2 min，吸水纸擦干切片后滴加荧光素标记的羊抗鼠多克隆IgG(1∶100，Zymed)，37℃孵育20～30 min。Cx43阳性的表达区域由Image－Pro Plus 4.0软件及专用显微镜组成的计算机图像处理系统进行定量测定，其结果通过Cx43阳性表达区域在总面积中所占的比例表示。

3 统计学处理

使用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，正态分布计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析;计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 动物的存活情况

Sham组25只大鼠，其中1只在饲养过程中死亡，存活率为96.00%(24/25)。75只造模大鼠11只在手术后3 d内死亡，剩下64只随机分为TXL组和MI组，每组32只。到药物灌胃治疗结束时，TXL组有3只大鼠死亡，存活率为90.62%，MI组有10只死亡，存活率为68.75%。TXL组的大鼠存活率高于MI组(P＜0.05)。

2 心肌IL-1β及ET-1水平的测定结果

Sham组心肌组织未能检测出IL－1β，而TXL组梗死周边区IL－1β水平显著低于MI组(P＜0.01)。与sham组相比，MI组梗死周边区的ET－1水平显著升高(P＜0.01)。经TXL治疗后，TXL组心梗周边区的ET－1水平较MI组下降(P＜0.01)，见图1。

Figure 1.The levels of IL－1β and ET－1 in the cardiac tissues of the rats with different treatments.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.图1 3组动物心肌IL-1β及ET-1水平的比较

3 Cx43 mRNA的表达结果

RT－PCR结果显示，MI组梗死周边区Cx43的mRNA水平较sham组显著下降，而给予TXL治疗后，TXL组梗死周边区Cx43的mRNA水平较MI组升高(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.The mRNA expression of Cx43 in the cardiac tissues of the rats with different treatments.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs MI group.图2 3组动物心肌梗死周边区Cx43 mRNA表达的比较

4 Cx43的蛋白表达结果

Western blotting实验检测了Cx43及p－Cx43蛋白在3组动物间的表达，结果显示，与sham组相比，MI组梗死周边区心肌Cx43蛋白总表达量及磷酸化水平均显著下降(P＜0.01)。给予TXL治疗后，梗死周边区的Cx43蛋白总表达量及磷酸化水平均较MI组明显升高(P＜0.01)。此外，虽然TXL组梗死周边区的Cx43蛋白总表达量较sham组下降(P＜0.05)，但磷酸化的Cx43蛋白水平在2组间却无明显差异(P＞0.05)，见图3。

5 在体VA诱发的结果

Sham组只有1只动物诱发出了非持续性VA，VA诱发率为8.33%。MI组的VA诱发率为90.00%，且66.70%为持续性VA，与sham组比较，差异显著(P＜0.01)。经TXL治疗4周后，VA的诱发率为52.94%，持续性VA的诱发率为17.64%，均较MI组明显减低(P＜0.05)，见图4。

6 Cx43的含量及分布结果

Sham组的Cx43多分布在心肌闰盘处，与心肌纤维走行垂直;MI组的Cx43表达较sham组明显减少(P＜0.01)，且几乎均分布于心肌侧面，与心肌纤维走行平行;TXL组的Cx43表达较MI组增加(P＜0.01)，且可见部分Cx43分布于闰盘处，见图5。

Figure 3.The protein level of Cx43 in the cardiac tissues of the rats with different treatments.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.图3 3组动物心肌Cx43蛋白表达的比较

Figure 4.The typical ECG images of VA and the incidence of VA in the rats with different treatments.图4 3组动物典型的室性心律失常诱发结果图

Figure 5.The immunofluorescent staining for Cx43 expression(arrows)from the border zone of the cardiac tissues in the rats with different treatments(×400).Cx43 signals were mainly located at end－to end apposition among the neighboring cells in the sham group.In contrast，infarction markedly decreased Cx43 expression.After administration of TXL，Cx43 signals were increased.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.图5 3组心肌梗死周边区Cx43的表达及分布情况

讨论

心肌梗死后常易并发各种心律失常，其中VA尤为多见，是心肌梗死患者发生心源性猝死的主要原因［2，6］。TXL是一种临床上广泛应用的中成药，由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、赤芍、土鳖虫等12种中药成分组成，具有益气通络、化瘀通络、流气通络等作用。既往研究证实，TXL可通过改善心肌梗死后交感神经重构及电重构(包括缩短心肌动作电位时程、延长有效不应期及减小心室跨壁离散度等)进而抑制心肌梗死后VA的发生［4，7］。近些年的一些研究显示心肌梗死后Cx43的重构也参与了心肌梗死后VA的发生［1－2］。然而，TXL对心肌梗死后Cx43重构的影响及其与梗死后VA的关系既往并无相关研究。本研究首次对这一问题进行了初步探讨，以期为TXL治疗心肌梗死后VA提供一定的理论依据。

哺乳动物心肌细胞间广泛存在缝隙连接蛋白，心室组织中以Cx43为主，它与心脏维持正常的电传导密切相关。在一些病理条件下，为适应心功能的变化，缝隙连接蛋白可在短时间内发生重构。这种重构容易诱发各种心功能紊乱，其中恶性心律失常的发生尤为多见［8］。心肌梗死后心肌细胞Cx43的重构，主要涉及Cx43表达量显著减少、侧面化分布增加及磷酸化水平降低3个方面。其中，Cx43表达量显著减少可引起心肌细胞电传导速度减慢［9］。而Cx43的侧面化分布一方面使心肌细胞电信号由各向异性传导的形式转变为绕弯式传导，为折返的发生提供基础［10］;另一方面这些侧面化分布的Cx43可以以半通道的形式开放释放ATP，同时促进Na+通过Cx43半通道内流诱发延迟后除极，进而诱发心律失常［11－12］。此外，有研究证实Cx43的磷酸化水平与Cx43的分布特点有明显的相关性，具体表现为磷酸化Cx43水平增加则Cx43多分布于心肌闰盘处，而非磷酸化Cx43水平增加则Cx43多分布于心肌侧面［13］，即心肌梗死后Cx43磷酸化水平的降低可促进Cx43的侧面化分布，进而为心律失常的发生提供条件。总之，Cx43这3个方面的重塑在一定程度上发挥协同作用，最终导致VA的发生。本研究发现，心肌梗死大鼠经TXL治疗后可以上调梗死周边区Cx43的表达量、促进Cx43的正常分布及增加Cx43磷酸化水平，这可能是TXL可以减少心肌梗死后VA发生的重要原因。

此外，既往研究显示心肌组织中的IL－1β及ET－1水平与心肌Cx43蛋白表达量有关［14－15］，其中IL－1β可通过核因子κB途径抑制Cx43合成，而ET－1则通过PLC/DAG/PKC途径使Cx43过度磷酸化而诱导Cx43的降解。在本研究中，TXL减少了心肌梗死大鼠梗死周边区IL－1β及ET－1水平，我们推测这可能与TXL上调梗死周边区Cx43的表达量有关。

总之，TXL可降低心肌梗死大鼠的VA发生率，其机制可能与TXL抑制心肌梗死后Cx43重构有关。

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Effects of Tongxinluo on connexin 43 remodeling and ventricular arrhythmia after myocardial infarction in rats

LI Hua－bo，CHEN Shi－jian，HU Jian－hua，WANG Lian－kai

(Department of Cardiovascular Diseases，The Min Da Hospital Affiliated to Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China.E-mail:1249245691@qq.com)

AIM:To determine the effects of Tongxinluo(TXL)on connexin 43(Cx43)remodeling and ventricular arrhythmia(VA)after myocardial infarction(MI)in rats.METHODS:Male SD rats were randomly divided into sham－operated(sham)group(n=25)and operation group(n=75).The left anterior descending(LAD)was ligated in operated group，while the rats in sham group only underwent pericardiotomy.The rats in operation group which survived for 3 d after operation were randomly assigned to TXL group and MI group.The rats in TXL group was administrated with TXL (2 g·kg－1·d－1，intragastric administration)for 4 weeks，while normal saline was applied to the rats in sham group and MI group.The levels of interleukin－1β(IL－1β)and endothelin－1(ET－1)in the tissue from the border zone were measured by ELISA after treatment.The distribution and the mRNA and protein expression of Cx43 were detected by immunohistochemical staining，RT－PCR and Western blotting，respectively.The burst pacing was used to induce ventricular arrhythmia (VA).RESULTS:Compared with sham group，the levels of IL－1β and ET－1 and the incidence of VA were significantly increased，while the mRNA and protein expression of Cx43 was markedly reduced with irregular distribution in MI group (P＜0.05).Compared with MI group，the levels of IL－1β and ET－1 and the incidence of VA were significantly reduced，while the expression of Cx43 at mRNA and protein levels was markedly increased with augmented linear distribution in the myocardial cell intercalated disc in TXL group(P＜0.05).CONCLUSION:TXL reduces the incidence of VA after MI via inhibiting the Cx43 remodeling.

Myocardial infarction;Tongxinluo;Connexin 43;Ventricular arrhythmia

R542.2+2;R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.015

1000－4718(2015)02－274－05

2014－09－03

2015－01－04

恩施州2013年农社领域技术研发项目

△通讯作者Tel:0718－8301036;E－mail:1249245691@qq.com