2型糖尿病发病不同阶段的运动干预对大鼠骨代谢及骨髓瘦素和瘦素受体蛋白表达的影响

高海宁，王艳杰，赵丹玉，崔 勇，柳 春，常 波

(1.辽宁中医药大学基础医学院，辽宁沈阳 110032;2.沈阳体育学院运动人体科学学院，辽宁沈阳 110102)

上个世纪50年代，就有报道说长期血糖控制不佳的糖尿病患者易发生骨质疏松。糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)与骨质疏松(Osteoporosis，OP)的关系越来越引起人们的关注。有报道2型糖尿病可引起骨量减少、不变或增加，报道结果的不一致可能与糖尿病的病程及并发症等等因素相关。运动干预是否能改善2型糖尿病骨代谢的状况，2型糖尿病的发生、发展的不同阶段施加运动干预，对大鼠骨代谢指标及骨髓瘦素和瘦素受体蛋白表达的有怎样的影响，尚未见相关报道。本研究采用小剂量STZ诱导长期高脂膳食的SD大鼠，造2糖尿病动物模型，重点在2型糖尿病大鼠发生、发展的不同阶段运动干预对大鼠骨代谢及骨髓瘦素和瘦素受体蛋白表达的影响，为运动防治2型糖尿病大鼠骨质疏松的机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

选用刚断乳雄性SD大鼠55只，购置于成都达硕生物科技有限公司。大鼠自由摄食摄水，每天记录其摄食量，定期称体重。饲养环境温度及湿度适宜。

1.2 实验方法

将大鼠随机分成正常对照组、DCG组、ZLG组、YFG组、FZG组，共5组，每组各11只大鼠。除NCG组实验过程中全程喂食普通饲料外，各糖尿病组适应性喂食后全程喂食高脂高糖饲料。高脂高糖饮食喂养六周后，大鼠腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)35 mg/kg，注射72 h后尾部静脉取血，使血糖值高于16.7 mmol/L，成功造2型糖尿病大鼠模型。糖尿病造模前对YFG组(1～6周)和FZG组(1～6周)进行为期六周的游泳训练，造模后ZLG组(7～12周)和FZG组(7～12周)进行为期六周的游泳训练。训练方案为:第1周，大鼠一天游泳10 min，以后每天加游10 min，最长游泳时间不超过50 min，每周调整1 d，运动6 d;第二周开始，大鼠每天运动两次，每次时长50 min，中间休息50 min。动物泳池水温严格按照大鼠习性控制在32℃ ～36℃，水深控制在50 cm。

由于高脂饮食及运动等多种因素，造成实验中大鼠死亡6只，最终采样时各组大鼠数量:NCG组11只、DCG组10只、ZLG组9只、YFG组10只、FZG组9只。各组大鼠末次运动结束后24 h内、禁食12 h后取材，氨基甲酸乙酯麻醉后腹腔静脉取血，3500 rpm离心，10 min，取上清，分装，置于－80℃深温冰箱内保存待检。实验主要指标的测定均在沈阳体育学院重点实验室内完成。

1.3 测试指标与方法

空腹血糖(GLU)采用血糖仪测定;血清胰岛素(Insulin)采用放射免疫法测试;血清骨钙素(BGP)采用放射免疫法测试;血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)采用酶联免疫法测试;血清糖化血清蛋白(GSP)采用果糖胺法测试。

实验相关试剂盒购置于南京建成生物工程研究所。所有指标严格按照试剂盒要求进行。股骨骨髓瘦素和瘦素受体蛋白表达使用Western blot法检测。具体测试方法:取各组大鼠同侧股骨，自然解冻，将股骨近端、远端用剪刀剪断，使用小吸尔球将股骨内骨髓吸出(或使用小镊子夹出)，处理各组骨髓组织，低温离心，取上清，用BCA试剂进行蛋白定量，并使各组蛋白浓度一致，各取样品50 μl，SDS上样缓冲液，100℃煮5 min，冷却后，每泳道加入上样量为 20 μl，10%SDS －PAGE 电泳液内电泳，并将蛋白转移到PVDF膜上。37℃下封闭2 h。一抗浓度1∶1 000，4 ℃过夜。二抗浓度1∶2 000，37 ℃孵育2 h后。使用DAB显色剂显色，结果用图像分析仪分析。

1.4 统计学方法

所有结果使用SPSS 17.0统计分析软件进行分析，实验数据用(X¯±S)表示，采用单因素方差分析方法统计。

2 实验结果

表1显示各组原始体重没有显著性差异;与NCG组相比，高脂饮食使各组注射STZ前体重均显著升高(P＜0.01)。在糖尿病发生发展不同阶段施加运动干预后，除FZG组体重接近NCG组，其余各组体重仍然显著高于NCG组(P＜0.05);与DCG组相比，ZLG组、YFG组和FZG组，体重均有下降的趋势，其中 ZLG组和 FZG组有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠体重

表2 各组血清血糖、糖化血清蛋白和胰岛素的变化情况

表2显示与NCG组相比，糖尿病各组血糖值均显著升高(P＜0.01)，糖化血清蛋白值显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，血清胰岛素值均显著升高(P＜0.01)。在糖尿病发生发展不同阶段施加运动干预后，ZLG组与DCG组相比，血糖、糖化血清蛋白和胰岛素值均有下降趋势，其中胰岛素变化有显著性(P＜0.05)。YFG组与DCG组相比，血糖、糖化血清蛋白和胰岛素值均有下降趋势，但变化无统计学意义。FZG组与DCG组相比，血糖、糖化血清蛋白和胰岛素值均有显著性下降(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)。

表3 各组血清抗酒石酸酸性磷酸酶及骨钙素的变化情况

表3显示与NCG组相比，DCG组抗酒石酸酸性磷酸酶显著升高(P＜0.01)，骨钙素显著降低(P＜0.01)。在糖尿病发生发展不同阶段施加运动干预后，与DCG组相比，ZLG组、YFG组及FZG组抗酒石酸酸性磷酸酶值有下降趋势，其中只有FZG组变化有统计学意义(P＜0.01);ZLG组、YFG组及FZG组骨钙素值有升高趋势，其中只有FZG组变化有统计学意义(P＜0.01)。

表4 各组股骨骨髓瘦素和瘦素受体蛋白的表达的变化情况(¯X±S)

图1、表4显示与NCG组相比，DCG组股骨骨髓瘦素含量显著升高(P＜0.01)，瘦素受体含量显著降低(P＜0.01)。在糖尿病发生发展不同阶段施加运动干预后，与DCG组相比，ZLG组、YFG组及FZG组骨髓瘦素含量有下降趋势，其中只有FZG组变化有统计学意义(P＜0.01);ZLG组、YFG组及FZG组骨髓瘦素受体含量有升高趋势，其中只有FZG组变化有统计学意义(P＜0.01)。

图1 五组大鼠股骨骨髓瘦素、瘦素受体蛋白含量表达图

3 分析讨论

糖尿病作为一种慢性非传染性疾病，严重威胁人类的健康［1］。据预测，到2025年全球糖尿病患者将剧增至3亿人［2］，将给社会和家庭带来巨大经济、精神负担。现在预防和治疗糖尿病的发生、发展已经成为社会关注的热点问题。美国糖尿病协会通过临床实践证明认为运动对于2型糖尿病的益处十分明显［3］。可见运动作为一种干预方法，在糖尿病的防治中发挥的作用已然得到社会的广泛认可。运动的糖尿病防治的作用机制如何，相关报道较多，研究结果不尽一致。本研究通过给肥胖大鼠注射小剂量的STZ诱导2型糖尿病的发生，从糖脂代谢、骨代谢角度分析运动干预在糖尿病发生发展不同阶段的作用机制，为糖尿病性骨质疏松的治疗提供实验依据。

本研究结果显示，与正常对照组相比，糖尿病对照组的糖代谢相关指标血糖、糖化血清蛋白及胰岛素测定结果显著升高(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)，可见长时间的高脂高糖饮食，大鼠出现糖代谢异常，主要表现血糖升高，胰岛素分泌增加。但长期的高胰岛素水平，抑制胰岛自身的活性，使胰岛对机体敏感性下降，耐受性升高，出现了胰岛素抵抗现象。同时本研究也证实，与正常对照组相比，反映破骨细胞活性的血清抗酒石酸酸性磷酸酶，糖尿病对照组显著升高(P＜0.01);而反映骨形成瞬间变化的生化指标骨钙素显著性降低(P＜0.01)，长期高脂高糖的膳食也造成大鼠骨代谢的异常，骨吸收大于骨形成，骨质疏松发生率明显提升，与他人研究结果一致［4］。骨质疏松是糖尿病并发症之一，并依据糖尿病病程的长短、治疗方案的采用、用药种类的选择等等因素的不同，发病率也不尽相同。

本研究中，在2型糖尿病大鼠发病前使其运动6周为预防运动组(YFG)，在发病后运动6周为治疗运动组(ZLG)，在发病前后均运动共游泳12周为防治运动组(FZG)。ZLG组与DCG组相比，血糖、糖化血清蛋白和胰岛素值均有下降趋势，其中胰岛素变化有显著性(P＜0.05)。YFG组与DCG组相比，血糖、糖化血清蛋白和胰岛素值均有下降趋势，但变化无统计学意义。FZG组与DCG组相比，血糖、糖化血清蛋白和胰岛素值均有显著性下降(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)。可见运动疗法作为糖尿病康复治疗中公认的最基本的治疗方法之一，在糖尿病发生发展的不同阶段施加对糖代谢调节作用大致趋势一致，均能降低血糖、降低血清胰岛素水平，改善胰岛素抵抗作用，一定程度上纠正糖代谢紊乱。但ZLG组和YFG组降糖作用不及全程运动的FZG组效果佳。由此可得对于糖尿病的糖代谢紊乱，长期有氧运动纠正效果更好。同样，与DCG组相比，ZLG组、YFG组及FZG组抗酒石酸酸性磷酸酶值有下降趋势，其中只有 FZG组变化有统计学意义(P＜0.01);ZLG组、YFG组及FZG组骨钙素值有升高趋势，其中只有FZG组变化有统计学意义(P＜0.01)。在糖尿病发生发展的不同阶段施加对骨代谢调节作用大致趋势一致，均能降低血清中抗酒石酸酸性磷酸酶值、提高骨钙素含量，一定程度上促进骨合成，纠正骨代谢紊乱。但ZLG组和YFG组作用不及全程运动的FZG效果佳。由此可得出对于糖尿病的骨代谢紊乱，长期有氧运动纠正效果更好。

运动对2型糖尿病大鼠骨代谢的调节，除与糖代谢的调节有关外，考虑与骨髓瘦素作用有关。上个世界末，Friedman等［5］成功克隆出肥胖基因(ob gene)，而瘦素是ob基因的蛋白质产物，由脂肪细胞分泌产生。骨髓中脂肪细胞可以分泌瘦素。瘦素作用很多，一方面瘦素进入血液循环，可通过血脑屏障，与下丘脑饮食中枢的瘦素受体结合，从而抑制食物摄入、增加能量消耗，使机体产热，最终起到减轻体重的作用;另一方面为瘦素可使骨髓基质细胞向成骨细胞分化，促进骨基质蛋白、骨钙素等合成和促进成骨细胞成熟并抑制破骨细胞生成，还可有效减少骨小梁的丢失。但瘦素对骨组织的作用较为复杂，曾有研究显示，向缺乏瘦素小鼠的第三脑室注射瘦素，可抑制骨形成，减少骨量［8］。但对于先天性瘦素缺乏的儿童皮下注射重组瘦素，却可以增加骨量，减轻体质量和体脂含量［9］。因此瘦素作用不仅依赖于瘦素的基础水平，而且与其作用部位(中枢或外周)密切相关［10］。瘦素调节骨代谢作用的产生的前提条件同样是瘦素要与其靶细胞表面的瘦素受体结合［11］。

本研究中糖尿病各组大鼠体重通过有氧运动干预均有所降低，虽然与NCG组还有一定的差距，但ZLG组和FZG组与DCG组相比体重下降有统计学意义(P＜0.05)。当然，运动作为一种糖尿病康复治疗手段之一，能增加机体能量消耗，降低体重，加速体内脂肪分解，减少体内脂肪量，增加脂肪量变化数据－－"同时测定内脏脂肪量，发现与DCG组相比NCG组内脏脂肪量显著升高(P﹤0.05)，糖尿病各运动组与DCG组相比，内脏脂肪总量有降低趋势，其中 FZG组变化有显著性差异(P﹤ 0.05)。［12］。表4显示，与 NCG 组相比，DCG 组股骨骨髓瘦素含量显著升高(P＜0.01)，瘦素受体含量显著降低(P＜0.01)。高脂膳食使2型糖尿病大鼠体重增加，超重达25%之多，推导体重的增加主要是脂肪重量的增加，高脂肪量使骨髓脂肪细胞增多，瘦素蛋白增多，瘦素与其靶细胞表面的瘦素受体结合才能发挥作用，而DCG组瘦素受体含量明显降低，因此，DCG组大鼠破骨细胞生成增多，成果细胞成熟减少，出现骨代谢异常，导致糖尿病性骨质疏松的发生。与DCG组相比，ZLG组、YFG组及FZG组骨髓瘦素含量虽然有所下降，但骨髓瘦素受体含量有升高趋势，且FZG组变化有统计学意义(P＜0.01)。增加分析运动时长的不同，各组对骨代谢的调节也不同。与黄立平等研究结果一致［12，14］。全程长期的有氧运动，可以使过剩的脂肪组织消耗，增加瘦体重，又可起到降糖和调节糖代谢的作用，缓解胰岛素抵抗，同时还可以提高骨髓脂肪细胞瘦素受体蛋白表达，促进瘦素与其受体结合，调节骨代谢，促进成骨细胞成熟并抑制破骨细胞生成，有效防治糖尿病性骨质疏松的发生。

4 结论与建议

在糖尿病发病不同阶段施加运动干预，可以不同程度改善2型糖尿病大鼠糖代谢紊乱，促进大鼠骨代谢调整，缓解瘦素抵抗。在糖尿病发病全程施加运动干预效果最佳。

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［7］Bouassida A，Chamri K，et al.Review on leptin and adiponectin response and adaptation to acute and chronic exercise［J］.Sports medicine，2010，44(9):620 －630.

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