不同温育条件对酶联免疫吸附试验法测定乙型肝炎表面抗原结果的影响研究

宋 锦，彭卓玲，吴 斌，梁海英 (广东省湛江市第三人民医院，广东 湛江 524012)

ELISA 法检测是目前实验室生化检测的常用方法之一，在临床应用较为广泛。但ELISA 实验中各个操作环节均可对试验结果造成影响，进而出现假阳性或假阴性结果，其主要影响因素包括血液样本发生溶血、脂血及细菌污染、离心时间及离心转速、标本及实验试剂加样不准确，以及温度及温育、洗板、显色时间及温度等［1］。其中，不同温度及温育是实际操作中影响结果的重要因素之一。我们对不同温度及温育条件下ELISA法测定HbsAg 的阳性结果进行系统研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料:选择2014 年1 月～2014 年5 月我院住院患者HbsAg 阳性标本60 份，分离血清后置于-20℃冰箱中保存备用。

1.2 方法:采用DR-200BS 酶标仪、DRW-320 洗板机、HHW21-600BS 型数显恒温水浴锅等设备及仪器，另外HBsAg ELISA 试剂盒由上海荣盛生物药业有限公司提供，HBsAg 标准品广东省临检中心提供。检测时首先调节室温至25℃，从冷藏环境中取出试剂盒，在室温下平衡30 min，同时将浓缩洗涤液作1∶20 稀释，分别采用两种不同温度及温育时间进行实验，观察组标本采用37℃分别孵育10 min、20 min 及30 min，对照组采用25℃分别温育10 min、20 min 及30 min。试验操作严格按照试剂盒说明步骤进行操作，每个样本反复检测4 次，每次置于5 微孔平行检测，同时设空白对照孔一孔，阴性对照、阳性孔各两孔。具体步骤如下:平衡，从-20℃冰箱中取出待测血清及2 ～8℃冷藏环境中取出检测试剂盒，置于室温中30 min 待用;配液，用蒸馏水或去离子水将浓缩洗涤液作1∶20 稀释待用;加样，分别取待检样品加入各孔中，其中阴性对照组、阳性对照组及室内质控品各取50 μl;加酶，取酶标试剂50 μl 加入各孔中;温育，用封板膜妥善封板后置于不同的温育温度下孵育不同的时间;洗涤;取出封板膜后用洗板机洗涤酶标板5 次至扣干;显色，将显色剂A、B 各50 μl 加入各孔，不同温度条件下避光显色15 min;测定，将终止液50 μl 加入各孔，采用酶标仪:检测波长450 nm，参考波长630nm，测定各样品的OD 值。读数须在终止液反应后10 分钟内完成。阴性对照平均值小于0.1，阳性对照平均值大于1.2。Cutoff 值计算:Cov=阴性对照平均值OD 值×2.1，比较两组不同温育条件下样本的阳性率。

1.3 统计学方法:采用SPSS12.0 进行统计分析。

2 结果

2.1 两组阳性检测结果比较:观察组孵育10 min、孵育20 min、孵育30 min 的阳性率与对照组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

表1 两组阳性例数检测结果比较［例(%)］

2.2 两组OD 值均值比较:观察组孵育30 min 时OD 值明显高于对照组，两组比较差异具有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 两组OD 值均值比较

表2 两组OD 值均值比较

注:与对照组比较，①P ＜0.05

组别 例数 孵时育O1D0 值min孵时育O2D0 值min孵时育O3D0 值min观察组30 1.81±0.24 2.11±0.22 2.45±0.21①对照组30 1.65±0.21 1.95±0.23 2.13±0.33 P 值0.250 0 0.310 8 0.031 2

3 讨论

乙肝表面抗原(HbsAg)为乙肝病毒的外壳蛋白物质，广泛存在于患者的血液、阴道分泌物、精液、唾液、乳汁、泪液、汗液以及鼻咽分泌物等体液中，是临床检测已感染乙肝病毒的重要标志之一。酶联免疫吸附试验(ELISA)在临床应用较为广泛，是感染性疾病目前常用的血清学标志物免疫测定方法之一，也是免疫学及分子生物学当中最为中重要的方法之一，具有简便、快捷、特异性强、灵敏度高以及可重复性好等优点，同时该检测方法对实验室设备及仪器要求低，不存在放射性污染，因此在临床广泛应用［2］。尽管ELISA 操作过程简便，原理简洁，但在实际临床实验室工作中，经常出现不同操作者得到的不同测定结果的情况，除了由于操作者对整个测定过程没有进行标准化、操作细节出现偏差等因素对测定结果影响之外，温育温度和温育时间是影响检测结果不可忽视的因素之一。

我们对不同温度及温育条件下ELISA 法测定HbsAg 的阳性结果进行系统研究，观察组孵育10 min、孵育20 min、孵育30 min 的阳性率与对照组比较差异无统计学意义(P ＞0.05);观察组孵育30 min 时OD 值明显高于对照组，两组比较差异具有统计学意义(P ＜0.05);提示两组不同条件下检出率基本一致，而37℃孵育30 min 的检出率略优于其他实验条件，但差异无统计学意义(P ＞0.05)。试验显示，在同一孵育温度下，反应时间在10 ～30 min 内其OD 值与反应时间呈线性关系，即反应时间越长，则OD 值越大。以上研究结果表明，在实验设备及仪器、试剂、操作、离心时间及离心转速、洗板、显色时间均一致的条件下，37℃孵育30 min OD 值高于25℃反应条件，检出率随之升高。为进一步提高检验结果的准确性，在采用37℃孵育30 min反应的前提下，仍需要做好以下几点:首先严格选择试剂，保证试剂的质量，购买时严把三证齐全的关卡，禁止使用过期的试剂;试剂盒必须置于室温平衡30 min 后方可使用。同时，注意保持标本的新鲜性，最好是当天采集的标本当天进行检测［3］;若标本采集后如无法进行及时检测则需分离血清置于-20℃以下保存备用，严禁反复冻融。严格控制反应温度，温育中应封闭样本，防止边缘效应的产生。洗板时需彻底，但切忌过度洗板，防止抗原抗体复合物脱掉;显色时应严格按操作时间，每批测试均需做室内质控，同时要建立完善审核制度［4］。总之，37℃孵育30 min OD 值高于25℃反应条件，检出率高，值得推荐，同时配合严格的操作细节，保证检验结果的可靠性和准确性。

［1］ 李金明.临床酶免疫测定技术［M］.北京:人民军医出版社，2005:87-90.

［2］ 葛君琍，王丽娜.不同温育方式对ELISA 法检测HbsAg结果的影响［J］.国际检验医学杂志，2013，34(2):194.

［3］ 郭 翀，张真铭.ELISA 法检测HBsAg 实验条件的优化［J］.国际检验医学杂志，2011，32(6):656.

［4］ 刘 婷.3 种不同实验条件的ELISA 法检测HBsAg 的比较研究［J］.中外医学研究，2012，10(726):48.