货架期线椒内部品质的近红外漫反射光谱检测*

潘冰燕，鲁晓翔，张鹏，李江阔，陈绍慧

1(天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津，300134)

2(国家农产品保鲜工程技术研究中心，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津，300384)

辣椒中叶绿素和类胡萝卜素的组成及含量不仅影响辣椒的商品价值，也影响其内部营养品质，是反映辣椒品质的重要指标之一。天然类胡萝卜素在生物体内具有抗氧化性，能降低人的癌症风险、增加免疫能力。西班牙学者的研究表明［1］，辣椒果实成熟过程中大量合成的红色类胡萝卜素为辣椒所特有。叶绿素共有叶绿素a、b、c和d四种，在绿色植物中主要为叶绿素a和b。传统方法对辣椒中叶绿素、类胡萝卜素的检测，时间长，操作流程繁琐，不适合现场对辣椒品质的快速检测。因此，开发一种简便、无损的叶绿素、类胡萝卜素含量快速检测方法对监控物流过程中辣椒品质变化具有重要意义［2］。

近红外光是波长介于可见区与中红外区之间的电磁波，其波长约为800～2 500 nm，波数约为12 500～4 000 cm－1。利用近红外光谱技术(near infrared reflectance spectrum，NIRS)测试样品，不需预处理就能直接对试样进行测试，操作方便，非常适合食品的定性和定量的快速分析［3－6］。近年来，NIRS在食品品质无损检测方面得到迅速发展和应用。Davey等［7］通过近红外光谱测定香蕉中的类胡萝卜素含量。郭卫东等［8］建立了用于测定樱桃中糖含量的CWT-GRNN预测校正模型;Park［9］分析了近红外光谱对水果SSC和硬度的预测水平;石吉勇等［10］利用NIRS对黄瓜植株氮、镁元素的亏缺进行诊断;果蔬品质无损检测在国内外已有一定研究［11］，有的已实现商业应用，但关于利用NIRS无损检测辣椒叶绿素、胡萝卜素的报道却鲜见。本文利用NIRS对线椒的叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量进行检测，建立货架期线椒鲜果内部品质快速、无损检测方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

原料:线椒采收时选取成熟度一致(八成熟、绿色)、无病虫害和机械损伤，并在当天运回实验室，待线椒的温度与室温一致时，用微孔袋(厚度16 μm)包装。置于常温(可控温度为18～20℃)下存放。

每隔24 h进行光谱测定，每次随机抽取30个样品，光谱测定后再进行化学成分含量的测定。测定前将辣椒表面拭擦干净，并对其进行排序编号，之后进行全光谱扫描。剔除异常数据之后，试验共抽取180个数据，其中定标集135个和验证集45个。

1.2 光谱采集

试验使用NIRSDS2500近红外漫反射光谱仪(丹麦Foss公司)，采用全息光栅分光系统，信号采集由硅(400～1 100 nm)和硫化铅(1 100～2 500 nm)检测器完成，扫描波长范围为400～2 500 nm，以单波长方式进行快速扫描，扫描次数为32次，配置Nova分析软件和WinISI4定标软件，将每一个线椒样品的中部凸表面点作为NIR漫反射光谱的采集点，要求避开表面缺陷部位，并对扫描部分进行化学测量。

1.3 叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的化学测定

参考Lichtenthaler等［12］提出的方法，稍做调整。准确称取切碎的辣椒鲜果0.500 g，放入研钵中，加入少量的石英砂和CaCO3粉以及2～3 mL的体积分数(下同)95%乙醇研成匀浆，再加95%乙醇10 mL，继续研磨至组织变白，静置3～5 min，用滤纸过滤到25 mL棕色瓶中，用95%乙醇定容。以95%的乙醇为空白，用紫外分光光度计分别在波长665、649、470 nm下测定吸光度。根据公式(1)、(2)和(3)进行叶绿素和类胡萝卜素的百分含量计算。

其中:m，样品质量，g;Ca，叶绿素 a含量，%;Cb，叶绿素 b含量，%;Cx*c，类胡萝卜素含量，%;D665、D649、D470分别是 665、649、470 nm 下的吸光度值;Ca、Cb和Cx*c分别乘以1 000可得到叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量(按mg/100g计)。

1.4 模型的建立与验证

利用WinISI4软件，对原始光谱进行滤波和平滑处理，以去除噪声，并提取有效信息，采用不同预处理确定线椒叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素无损预测模型;然后，再用未参与定标的样品对模型进行验证，评价模型的可行性。为了模型的实用性，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量的最小值以及最大值被选入定标样品集中。以定标集相关系数RCV和交叉验证误差(standard error of cross validation，SECV)，验证集相关系数RP和验证标准误差(standard error of prediction，SEP)为模型的评价标准。通常，所建立模型的RCV和RP越大，SECV和SEP越小，模型的效果越好［13］。本实验模型定标集和验证集样品的分布特征如表1所示。

2 结果与分析

2.1 常规分析基本参数

选取线椒果实凸表面点做好标记，并对标记点处进行扫描，得到线椒果实的原始近红外扫描光谱图1。

表1 定标集和验证集样品的分布特征Table 1 Characteristics of calibration and prediction

图1 货架期间辣椒原始光谱图Fig.1 Original absorption spectrum of shelf-life of Line pepper

图1为货架期间线椒鲜果的180个原始吸收光谱图，近红外光谱会受到化学成分种类和含量的影响，而样品本身物理性质也会影响其光谱。从图1中可以看出光谱在波长为677、975、1 191、1 448 nm 的处有明显吸收峰。通过WinISI 4软件分析可知，在可见光区，出现第一个明显的吸收峰(677 nm)，这可能是由果皮叶绿素对光的吸收造成的［14］。而水分对近红外的吸收带为960 ～990 nm;1 198 ～1 270 nm［15］。也有研究认为［16］，975 nm和1 448 nm的吸收可能是由水和CO2的吸收引起的。陆婉珍等［17］的研究则认为，果蔬成分中基本化学基团(C—H、O—H)的倍频吸收谱带也在这几个峰附近。这说明近红外光谱图捕获的信息与线椒鲜果内在品质之间存在着一定的变化规律。

2.2 不同预处理方法的选择

采用改进最小偏二乘法(MPLS)，研究光谱不同导数处理方法结合不同散射和标准化方法处理模型的方法，从而找出最优的模型。在全光谱范围内(400～2 500 nm)比较了原始光谱［Log(1/R)］、一阶微分光谱［D1Log(1/R)］、二阶微分光谱［D2Log(1/R)］和去散射处理(Detrend)、标准正常化处理(SNV)、SNV和Detrend、标准多元离散校正(standard multivariate discrete calibration，SMSC)、加权多元离散校正(weighted multivariate discrete calibration，WMSC)相结合的方法建立的模型。王加华等［18］的研究指出，多元离散校正(MSC)可以解决样品的不均匀、粒径大小和光程长短等物理特性对光谱的影响;导数光谱可对基线和其他背景的干扰进行有效地消除，分辨重叠的峰，达到提高分辨率的效果，但其同时也会引入噪声，降低信噪比。

本实验在全光谱范围内比较叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的相关系数RCV和交叉验证误差SECV，用不同光谱预处理方法建模的结果如表2所示。

表2 叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量不同预处理的定标结果Table 2 Statistical results of Chlorophyll a and Chlorophyll b and Carotenoids by different pretreatment

结果表明，对于叶绿素a和叶绿素b都是采用MPLS、D1Log(1/R)、Detrend处理的定标模型较好，交互验证相关系数(RCV)分别为0.907和0.896，交互验证误差(SECV)分别为0.744和1.544;对于类胡萝卜素，采用 MPLS、Log(1/R)、Detrend处理的定标模型较好，交互验证相关系数(RCV)、交互验证误差(SECV)分别为0.902和0.336。

表3 叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量最优预处理不同波段下的定标结果Table 3 Statistical results of Chlorophyll a and Chlorophyll b and Carotenoids in best pretreatment at different bands

针对叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量的最优预处理进行不同波段的讨论，结果见表3。表明在408～1 092.8 nm波长下建立的模型的交互验证相关系数(RCV)、交互验证误差(SECV)略小于全波长建立的模型，而在波长1 108～2 492.8 nm下所建立的模型效果不好。这可能是由于叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的光谱吸收峰大多集中在可见光区域或短波近红外区域，模型的光谱信息主要在这段区域。

2.3 叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量近红外检测模型建立及分析

为了预测定标模型的可靠性和准确性，用建立好的最优定标模型分别对45个未知辣椒果实的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量进行预测分析，实测值与预测值相关性分别如图2～图4所示。

预测结果表明，叶绿素a的预测标准误差(SEP)为0.894，预测相关系数(RP)为0.890 2;叶绿素b的预测标准误差(SEP)为1.647，预测相关系数(RP)为0.923 7;类胡萝卜素的预测标准误差(SEP)为0.361，预测相关系数(RP)为0.905 9。可见，叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素都可以进行很好的预测。因此，可见/近红外漫反射对线椒鲜果叶绿素、类胡萝卜素的快速无损检测是可行可靠的。

图2 叶绿素a实测值与预测值相关性Fig.2 Correlation between predicted values of model optimized and actual values of chlorophyll a

图3 叶绿素b实测值与预测值相关性Fig.3 Correlation between predicted values of model optimized and actual values of chlorophyll b

图4 类胡萝卜素实测值与预测值相关性Fig.4 Correlation between predicted values of model optimized and actual values of carotenoids

3 结论

本研究应用近红外漫反射光谱结合改进偏最小二乘法(MPLS)建立了线椒鲜果叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的定量模型。MPLS是一种全光谱分析方法，充分利用多个波长下的有用信息，无需刻意地选择波长，解决交互影响的非线性问题，很适合在近红外中使用。通过对不同预处理方法模型的比较，得出在MPLS校正模型下，叶绿素a以及叶绿素b最优的预处理方法为D1Log(1/R)+Detrend处理，对采集到的原始光谱进行一阶导预处理［D1Log(1/R)］，可以过滤噪声，提高信噪比，消除基线飘移的干扰，提高模型质量;类胡萝卜素的最优预处理方法为Log(1/R)+Detrend。可见，去散射处理(Detrend)对这3种组分的模型最优，这可能是由于辣椒果皮对近红外光的透入有较大影响，但这种影响可以通过Detrend处理被减小或被补偿，这在赵杰文等［18］的研究中也曾得到证明。叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素的最优处理方法不同，说明对于不同物质间的最优模型的预处理方法有所不同。叶绿素b与类胡萝卜素的预测相关系数(RP)都达到了0.9以上，叶绿素a预测相关系数(RP)也达到了0.890 2。实验结果表明，近红外漫反射光谱技术能克服传统分析方法的繁杂处理过程，实现对辣椒鲜果中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的同时快速无损检测，从而达到评价线椒货架期品质的目的，而且一次测定可同时预测叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量，实用性更强。本研究方法可利用在对线椒鲜果货架及贮藏期品质的检测方面。

［1］ Dámaso H M，Ricardo G L G，M Isabel M M.Carotenoid biosynthesis changes in five red pepper cultivars during ripening［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(9):3 857 －3 864.

［2］ 季淑娟，魏宝东，程顺昌.我国蔬菜物流现状与发展对策［J］.保鲜与加工，2014，14(4):1－4.

［3］ 张鹏，李江阔，孟宪军，等.可见/近红外光谱漫反射无损检测磨盘柿果实硬度的研究［J］.食品工业科技，2011，34(7):423 －425.

［4］ 孙旭东，郝勇，高荣杰，等.脐橙糖度近红外光谱在线检测数学模型优化研究［J］.光谱学与光谱分析，2011，31(5):1 230－1 235.

［5］ 王敏，付蓉，赵秋菊，等.近红外光谱技术在果蔬品质无损检测中的应用［J］.中国农学通报，2010，26(5):174－178.

［6］ 王丹，鲁晓翔，张鹏，等.近红外光谱检测不同贮藏期磨盘柿的内部品质［J］.光谱实验室，2013，30(6):2 769－2 774.

［7］ Davey M W，Saeys W，Hof E，et al.Application of visible-and near-infrared reflectance spectroscopy(Vis/NIRS)to determine carotenoid contents in banana(Musa spp.)fruit pulp ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(5):1 742 －1 751.

［8］ 郭卫东，倪开诚，孙旭东，等.基于CWT和GRNN的可见-近红外漫反射光谱检测樱桃糖度的研究［J］.食品科学，2009，30(12):140 －142.

［9］ Park B，Abbott J A，Lee K J，et al.Near-infrared diffuse reflectance for quantitativeand qualitative measurement of soluble solids and firmness of Delicious and Gala apples［J］.Transactions of the ASAE，2003，46(6):17 －21.

［10］ 石吉勇，邹小波，赵杰文，等.近红外光谱技术快速无损诊断黄瓜植株氮、镁元素亏缺［J］.农业工程学报，2011，27(8):283 －287.

［11］ XU Hui-rong，QI Bing，SUN Tong，et al.Variable selection in visible and near-infrared spectra:Application to on-line determination of sugar content in pears［J］.Journal of Food Engineering，2012，109(1):142 －147.

［12］ 张其德.测定叶绿素的几种方法［J］.植物学通报，1985，3(5):60 －64.

［13］ 王丹，鲁晓翔，张鹏，等.近红外漫反射光谱检测不同贮藏期甜柿的内部品质［J］.食品科技，2013，38(11):264－271.

［14］ Cayuela J A.Vis/VIR soluble solids prediction in intact oranges(Citrus sinensis L.)cv.valencia late by reflectance［J］.Postharvest Bid Technol，2008，47(1):75 －80.

［15］ Wiliams P，Norris K H.Variable affecting near infrured spectroscopic analysis.In:WiliamsP，NorrisK H.(Eds.).Near Infrured Technalogy in the Agricuture and Food Industries［M］(Seconed).St.Paul，MN:The American Association of Cereal Chemist，2001:171 － 185.

［16］ 王宝刚，李文生，蔡宋宋，等.核果类水果干物质含量近红外无损检测研究［J］.光谱实验室，2010，27(6):2 118－2 123.

［17］ 王加华，孙旭东，潘璐，等.基于可见/近红外能量光谱的苹果褐腐病和水心鉴别［J］.光谱学与光谱分析，2008，28(9):2 098 －2 102.

［18］ 赵杰文，张海东，刘木华.利用近红外漫反射光谱技术进行苹果糖度无损检测的研究［J］.农业工程学报，2005，21(3):162 －165.