采用多重PCR技术检测转基因番木瓜华农一号*

白卫滨，曹春廷，朱翠娟，文罗娜，吴贤权，欧仕益，孙建霞2，

1(暨南大学食品科学与工程系，广州广东，510632)2(广东工业大学轻工化工学院，广东广州，510006)

目前，全世界范围内很多种转基因作物已经商业化，如大豆、玉米、棉花、油菜以及番木瓜等，而对转基因产品的安全性问题，还存在争议。因此，部分国家为保障本国消费者知情权和贸易壁垒，要求对转基因产品进行定性或定量标识。我国目前对转基因产品采取强制定性标识政策，而定性标识的技术基础是转基因成分检测方法的研究。目前，转基因检测方法有PCR 方法［1］、酶联免疫吸附法(ELISA)［2］、Western 杂交法［3］、近红外光谱法［4］。应用最为广泛的方法为PCR方法，已经应用于多种转基因产品的检测，如土豆［5－6］、玉米［7－10］、大米［11－12］等。

番木瓜是一种亚热带水果，但由于易受环斑病毒的感染而影响其产量，科学家采用转基因技术培育出抗环斑病毒的转基因番木瓜，抗环斑病毒转基因番木瓜品种主要有Event 55-1、GM-YK和华农一号，华农一号是我国自主研发的转基因番木瓜，已批准进入区域商业化，目前尽管已经建立了转基因番木瓜检测方法，但对华农一号快速筛选方法的建立仍需开展。目前已有多重PCR法同时检测Event 55-1和非法转基因品种［13］，实时荧光PCR 法研究 Event 55-1、GM-YK等非法转基因品种的污染［14］及基因流动性研究［15］等，但对华农一号研究很少。姜大刚等［16］利用TAILPCR法测定出插入位点后利用定性PCR检测华农一号，可达到0.05%的检测限。韩建勋等［17］用实时荧光定量PCR对包括华农一号在内的4种转基因产品进行研究，检出了台湾中兴大学研发的4个转基因品系。

但这些研究都只限于转基因番木瓜华农一号的品系检测，并不能同时对多种转基因番木瓜品种进行检测。因此本研究以华农一号为研究对象，通过对华农一号及另外2种已获批准商业化种植的抗病毒转基因番木瓜(Event 55-1、GM-YK)DNA的提取、通用引物及外源基因的设计、单重及多重PCR扩增技术研究，旨在建立针对转基因番木瓜华农一号转基因成分的简便快速、高灵敏度的多重PCR技术。

1 材料与试剂

1.1 试剂和仪器

DP305植物基因组DNA提取试剂盒;Taq DNA聚合酶体系2×MasterMix(包括0.1 U Taq Polymerase/μL、500 μmol/L dNTP each、20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2、其他稳定剂和增强剂);DNA Marker DL 2000，购于 TIANGEN公司;紫外分光光度计，美国Thermo公司 ;微量移液器，美国Thermo公司;ABI 2720 thermal cycler，Applied Biosystems;PCR扩增仪;Gel Doc1000凝胶成相系统，美国Bio Rad公司。

1.2 材料

实验材料采用3种转基因番木瓜(Event 55-1、GM-YK和华农一号)和普通番木瓜(台农2号)的新鲜叶片，并于－4℃保存备用。

2 实验方法

2.1 DNA提取与纯化

取各品种的新鲜番木瓜叶100 mg，加入液氮充分研磨，用DNA提取试剂盒提取DNA。采用紫外分光光度法测定DNA的浓度和纯度。为了方便PCR的操作和计算，3种DNA样品最后均稀释到100 ng/μL。

2.2 特异性引物基因的设计

3种转基因番木瓜的外源基因序列［17-18］(图1～图3)Papain(木瓜蛋白酶基因)是调控肽链内切酶和半胱氨酸蛋白酶的典型家族遗传基因，可作为木瓜的内标基因［19-20］。由于外源基因的插入，3种转基因番木瓜都有NPTⅡ(新霉素磷酸转移酶II基因)和35s(35S启动子)2种基因，RP(复制酶基因)仅存在于华农一号;CP(PRSV的外壳蛋白基因)仅存在于GM-YK和55-1两种番木瓜，这种特殊的基因分布决定了PCR特异性引物验证的实验设计。

图1 华农一号番木瓜外源基因Fig.1 Exogenous gene of papaya Huanong No.1

图2 GM-YK番木瓜外源基因Fig.2 Exogenous gene of papaya GM-YK

图3 55-1番木瓜外源基因Fig.3 Exogenous gene of papaya 55-1

根据3种转基因番木瓜的外源基因序列，设计4种特异性引物(见表1)并采用番木瓜特有的木瓜蛋白酶基因(Papain)作为内参基因。利用NCBI引物设计软件设计并从生工生物工程(上海)股份有限公司合成的5对引物对如表1所示。

表1 转基因番木瓜内、外源基因的PCR引物Table 1 PCR primers for endogenous and exogenous gene of transgenic papaya

2.3 特异性引物单重PCR检测研究

扩增采用反应体系为25 μL，含2×MasterMix(包括 0.1 U Taq Polymerase/μL、500 μmol/L dNTP each、20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2、其他稳定剂和增强剂)，10 mmol/L引物，DNA模板浓度均为20 ng/μL。

单重扩增程序为:预变性(94℃，3 min);30个循环:变性(94 ℃，30 s)，退火(60 ℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);终止延伸(72 ℃，5 min)。

多重PCR反应对扩增仪的设置为:预变性(94℃，3 min);30个循环:变性(94℃，30sec)，退火(62℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);终止延伸(72℃，5 min)。反应体系为 25 μL。

反应结束后取5 μL PCR产物于2%的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液中，稳压80 V电泳30 min，在紫外凝胶成像系统下检测。

2.4 特异性引物多重PCR验证

多重PCR反应对扩增仪的设置为:预变性(94℃，3 min);30个循环:变性(94℃，30 s)，退火(62℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);终止延伸(72 ℃，5 min)。反应体系为25 μL。其中，引物用量初始设计为1 μL(浓度为10 mmol/L)，经过反复验证，在五重PCR体系中进行了优化，获得了最终的多重PCR体系(见表2)。

反应结束后取5 μL PCR产物于2%的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液中，稳压80 V电泳30 min，在紫外凝胶成像系统下检测。

2.5 特异性引物的PCR扩增灵敏度分析

在五重PCR体系的基础上进行灵敏度分析，设置华农一号DNA模板的体系浓度梯度分别为100、20、5、1、0.2、0.05 ng，不改变 PCR 扩增仪的程序进行扩增，获取结果。

表2 五重PCR反应体系Table 2 Reaction system of fivefold PCR

3 结果与分析

3.1 不同转基因番木瓜DNA引物的特异性检测

本研究的引物是通过NCBI网站引物设计软件设计，通过数据库比对，筛选转基因番木瓜的特异性基因，进而根据该特异性基因确定特异性扩增引物，从理论上保证了引物的特异性，使其能在基因水平上反映种类的差异。

而在实验前期，采用番木瓜，苹果、橙子、草莓、芒果、梨、桃子、桑葚等常见水果品种进行了引物特异性的验证，发现设计的引物均有高度特异性，可应用于转基因番木瓜的鉴伪研究［21］。5对引物的PCR特异性验证电泳结果如图4所示。

图4 单引物PCR验证Fig.4 Verification of single primer PCR

由图1可知，各组引物都能扩增出单一的条带，其中CP引物可特异性对GM-YK和55-1两种转基因番木瓜进行扩增，得到单一条带，大小为103 bp;35s引物可特异性对华农一号和55-1两种番木瓜进行扩增，得到单一条带，大小为166 bp;NPTII引物可特异性对华农一号和55-1两种番木瓜进行扩增，得到单一的条带，大小为213 bp;Papain引物可特异性对转基因华农一号和非转基因台农2号2种番木瓜进行扩增，均得到单一的条带，大小为281 bp。RP引物可特异性只对转基因华农一号进行扩增，选择华农一号2种品种扩增都可得到单一条带，大小为369 bp。综上可得，5对引物的特异性均良好，可用于后续研究。

3.2 转基因番木瓜多重PCR引物特异性检测结果分析

多重PCR相对于单重PCR具有更高的检测效率，简便快捷且同时可以节约时间和资源，而且也能保持较高的灵敏度与准确性，值得深入研究［22］。本研究采用逐个增加特异性引物的方法，依次进行1-5重PCR扩增，得到1-5重的琼脂糖凝胶电泳结果见图5。

图5 1-5重PCR扩增结果Fig.5 Amplification results of multiple PCR

由图5可见，Papain引物和35s引物所在的1、2号条带清晰可见，大小分别为281 bp与166 bp，特异性表现良好;3号是在35s引物的基础上增加了NtpII引物，结果均出现较清晰的条带，NtpII大小为213 bp;4号为3重PCR，在3号基础上增加了Papain引物，扩增所得的3组条带均较为清晰可见;5号与6号条带分别选用了2种转基因番木瓜进行四重PCR的验证，由于华农一号不具备CP片段基因，而GM-YK转基因番木瓜含有除RP片段基因外的其余4种基因，故选用GM-YK作为包含CP基因的四重PCR检测中的实验材料，结果显示，增加了CP基因后，4条条带(Papain、35s、NtpII和 CP)仍清晰可见，其中CP大小为103 bp;6号在4号PCR结果的基础上增加了 RP引物，四条条带(Papain、35s、NtpII213和RP)仍清晰可见，其中RP大小为369 bp。

7号作为5重PCR体系的结果为，在含有华农一号与GM-YK 2种DNA模板的体系中，5种引物均扩增出了较为清晰的条带，条带大小也与各引物的特异性验证中的结果相一致。

3.3 转基因番木瓜多重PCR检测的灵敏度

为了验证转基因番木瓜类特异性引物五重PCR灵敏性，设置华农一号DNA模板的体系浓度梯度分别为 100、20、5、1、0.2、0.05 ng，以这些 DNA 样品为模板进行扩增。灵敏度验证结果如图6所示。扩增得到华农一号应有的4条条带，扩增效率随模板量减少而降低，同时条带的清晰度也随之下降，当模板量减少至0.05 ng时，已得不到目的条带。所以，该五重PCR的检测限为0.2 ng目标DNA。

图6 五重PCR灵敏度验证Fig.6 Verification of sensitivity of five-plex PCR

4 讨论

多重PCR具有高效性、系统性、经济简便性等特点，但成功的实现多重PCR并非易事。多重PCR在扩增过程中会遇见多个靶点扩增条件不兼容的问题，因此引物的设计及反应条件摸索极为重要。本文通过内源基因木瓜蛋白酶基因的使用和对3种转基因番木瓜外源基因特有基因分布研究，得到五对特异性引物，成功进行了特异性扩增。在进行五重PCR研究过程中，采用逐个增加引物的方法，并同时对反应条件，引物配比等影响多重PCR扩增的条件进行反复实验，最终实现五重PCR扩增。首次进行了以华农一号为研究对象的多重PCR研究，并建立了检测番木瓜中转基因成分的五重PCR技术，检测限为0.2 ng，达到了华农一号转基因番木瓜快速筛选的目的。

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