TLR9-1486和TLR9-2848基因多态性与胃癌易感性关系

石源源，韩璐，舒君，王笑峰，罗兵

(青岛大学医学院微生物学教研室，山东 青岛 266021)



TLR9-1486和TLR9-2848基因多态性与胃癌易感性关系

石源源，韩璐，舒君，王笑峰，罗兵

(青岛大学医学院微生物学教研室，山东 青岛 266021)

目的 探讨Toll样受体9 (TLR9)编码基因TLR9-1486和TLR9-2848位点多态性以及EB病毒(EBV)感染与胃癌易感性的关系。方法 选取131例胃癌病人为研究对象，包括43例EBV相关胃癌(EBVaGC)和88例EBV阴性胃癌(EBVnGC)，同时随机抽取66例健康人外周血标本作为对照。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测TLR9基因-1486位点T/C和-2848位点G/A多态性。结果 TLR9-1486T/C位点多态性分析显示，胃癌组和对照组3种基因型分布和等位基因频率比较差异无显著性(P>0.05)；EBVaGC组和EBVnGC组中各基因型分布和等位基因频率差异也无显著性(P>0.05)；与携带T等位基因者相比较，C等位基因携带者胃癌和EBVaGC发病风险无明显升高趋势。TLR9-2848G/A位点多态性分析显示，胃癌组和对照组3种基因型分布和等位基因频率差异无显著性(P>0.05)；EBVaGC组和EBVnGC组中各基因型分布和等位基因频率差异也无显著性(P>0.05)；与G等位基因携带者比较，A等位基因携带者胃癌和EBVaGC易感性无明显升高。结论 TLR9-1486和TLR9-2848位点多态性与胃癌易感性无关，且在EBVaGC发生中与EBV感染无协同关系。

胃肿瘤；Toll样受体9；多态性,单核苷酸；疱疹病毒4型,人

EB病毒(EBV)是传染性单核细胞增多症病原体，同时又与多种人类肿瘤的发生密切相关，包括伯基特淋巴瘤、霍奇金病、移植后淋巴瘤、鼻咽癌以及部分胃癌[1-2]。Toll样受体(TLR)是Ⅰ型跨膜蛋白受体，在启动天然免疫和调节特异性免疫中起重要作用，TLR信号调节异常可导致慢性炎症性疾病和

癌症的发病危险增加[3-4]。相关研究已表明，TLRs编码基因多态性可能增加罹患某些肿瘤的风险[5]。如TLR9-1486T/C (rs187084)和TLR9-2848G/A (rs352140)位点多态性可影响TLR9转录或蛋白质编码，进而影响其功能，并参与自身免疫性疾病和癌症的发生[6-7]。目前尚未见TLR9上述位点多态性与EBV相关胃癌(EBVaGC)相关性的研究报道。本研究选取EBVaGC、EBV阴性胃癌(EBVnGC)病人作为研究对象，探讨TLR9编码基因1486T/C和2848G/A位点多态性与胃癌发生的关系，以及EBV感染与TLR9基因多态性是否在EBVaGC发生中具有协同关系。

1 对象和方法

1.1研究对象

选取青岛大学附属医院收治的经病理检查确诊的胃癌病人131例作为胃癌组，采用原位杂交检测石蜡组织切片中EBV编码的小分子非多聚腺苷酸EBER1的表达来筛选EBVaGC，筛选出EBVaGC者43例和EBVnGC者88例。同时，选取青岛大学附属医院健康查体者66例作为对照组(均为非肿瘤病人，并排除各种感染及自身免疫病)，性别和年龄与胃癌组差异无显著性。采集两组空腹EDTA抗凝静脉血5 mL，分离外周血单个核细胞。

1.2组织细胞DNA提取

新鲜的胃癌组织和外周血单个核细胞DNA提取采用酚-氯仿-异戊醇法，石蜡包埋的胃癌组织DNA提取采用德国QIAGEN公司的QIAAmp FFPE DNA 提取试剂盒，操作参照试剂盒说明进行。

1.3TLR9编码基因1486T/C和2848G/A位点多态性检测

采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分别分析TLR9基因1486T/C和2848G/A两个位点多态性，所用引物序列和产物大小见表1。

表1 TLR9编码基因多态性分析所用引物序列及产物大小

TLR9编码基因1486T/C和2848G/A位点的PCR扩增条件相同，反应体系为30 μL，包括10×Buffer 3 μL，dNTPs 0.2 mmol/L，上下游引物各0.3 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，DNA 模板2 μL。循环条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共扩增35个循环；最后72 ℃延伸10 min。取6 μL的PCR扩增产物于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统记录电泳结果。每次PCR反应均用无菌双蒸水作阴性对照。

采用限制性内切酶AflⅡ(New England Biola-bs Inc., Ipswich, MA, USA)酶切1486T/C位点长565 bp的PCR产物，酶切体系20 μL，包括10×NEB缓冲液2 μL，PCR产物10 μL, 100×BSA0.2 μL, AflⅡ 0.5 μL，无酶双蒸水7.3 μL。混匀后瞬时离心，37 ℃水浴1 h。限制性内切酶BstUⅠ酶切2848G/A位点长360 bp的PCR产物，酶切体系为20 μL，包括10×NEB缓冲液 2 μL，BstUⅠ 0.5 μL，DNA 10 μL，无酶双蒸水7.5 μL。混匀后瞬时离心，60 ℃水浴1 h。上述酶切产物于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统记录实验结果。

1.4PCR产物测序

将上述部分经过PCR-RFLP鉴定分型的产物45 μL送北京华大基因有限公司进行序列测定，测序后用Chromas软件查看峰图文件，DNAStar软件(Larsergene,version 7.0)进行序列剪接和对比分析，并与相应TLRs野生型序列进行比对以验证PCR-RFLP结果。

1.5统计学处理

采用SPSS软件进行统计学处理，组间基因型、等位基因、等位基因携带者比较采用pearsonχ2检验，基因多态性与胃癌相关性用非条件Logistic回归分析，计算比值比(OR)，以双侧a=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1TLR9编码基因1486T/C位点多态性检测

本文131例胃癌组织DNA和66例对照组外周血DNA均扩增出TLR9基因1486T/C位点565 bp特异性条带，PCR产物Afl Ⅱ酶切后电泳条带仍为565 bp者为纯合突变CC基因型；酶切后出现416 bp和149 bp两条带者为纯合野生TT基因型；观察到416 bp、149 bp和565 bp共3条带者，则为杂合CT基因型。部分标本酶切产物电泳结果见图1。

M为DL 2000 DNA Marker；①、、、、为CC基因型；②～④、⑥、⑧～⑩、、、、为CT基因型；⑤、⑦、、、、、、为TT基因型。

随机选取不同基因型PCR产物进行测序分析，测序结果采用DNAStar软件与GenBank TLR9标

准型(野生型)DNA序列进行比较，其结果与PCR-RFLP鉴定结果一致。

胃癌组和对照组3种基因型分布和等位基因频率比较差异无显著意义(P>0.05)。EBVaGC组和EBVnGC组各基因型分布和等位基因频率差异也无显著性(P>0.05)。单自变量非条件Logistic回归分析(携带C等位基因者赋值为0,携带T等位基因者赋值为1)显示，胃癌组与对照组中，与携带T等位基因者相比较，携带C等位基因者有增加胃癌发病风险的趋势，但差异无显著意义(OR=1.231，95%CI=0.646～2.346，P>0.05)；EBVaGC组与EBVnGC组中差异也无显著性(OR=0.969，95%CI=0.429～2.188，P>0.05)。见表2。

2.2TLR9编码基因2848G/A位点多态性检测

本文131例胃癌组织DNA和66例对照组外周血DNA均扩增出360 bp特异性条带，以酶切产物电泳条带仍为360 bp者为纯合突变AA基因型；酶切产物电泳出现227 bp和133 bp两条带者为纯合野生GG基因型；酶切产物电泳观察到227 bp、133 bp和565 bp共3条带者则为杂合GA基因型。部分标本PCR产物BstUⅠ酶切后电泳结果见图3。同上方法对3种基因型PCR产物进行测序分析，其结果与PCR-RFLP检测结果一致。

M为DL 2000 DNA Marker；①、③、⑥、⑩、、、为GA基因型；②、④、、、、为GG基因型；⑤、⑦～⑨,、、、～为AA基因型。

胃癌组和对照组3种基因型分布和等位基因频率比较差异无显著意义(P>0.05)。EBVaGC组和EBVnGC组各基因型分布和等位基因频率差异也无显著性(P>0.05)。单自变量非条件Logistic回归分析(携带G等位基因者赋值为0，携带A等位基因者赋值为1)显示，胃癌组与对照组中，与携带G等位基因者相比，携带A等位基因者与胃癌发病风险无相关性(OR=0.985，95%CI=0.524～1.848,P>0.05)；EBVaGC组与EBVnGC组中差异也无统计学意义(OR=0.664，95%CI=0.298～1.480,P>0.05)。见表3。

表2 TLR9-1486T/C基因型和等位基因分布

表3 TLR9-2848G/A基因型和等位基因分布

3 讨 论

人类TLR家族已发现有11个成员，而目前研究最多的则是TLR2、3、4和9，其中TLR9在许多肿瘤组织中高表达，TLR9-1486T/C(rs187084)和TLR9-2848G/A(rs352140)位点多态性可能会影响TLR9基因转录或蛋白质编码。本研究结果表明，TLR9编码基因1486T/C和2848G/A位点多态性与胃癌的发病易感性无关，而且与EBV感染在胃癌发病易感性中也无协同关系。曾红梅等[8]自胃癌高发区山东临朐县选取248例胃癌病人，同时随机抽取496例胃炎病人作为对照，采用PCR-RFLP技术证实TLR2基因rs3804099位点多态性与胃癌发病风险密切相关，并与幽门螺杆菌感染存在协同效应；而TLR9基因rs187084位点多态性则与胃癌和幽门螺杆菌无相关性。WANG等[9]从江苏汉族人群中选取314例胃癌病人和314例健康对照者，采用PCR-RFLP技术检测分析，结果显示江苏省汉族人群中携带TLR9-1486T/C基因C等位基因者胃癌的易感性增加，携带C等位基因和幽门螺杆菌感染在胃癌发生发展中有协同作用。这些结果不同的原因仍不清楚，可能是地区差异造成遗传背景不同所致，也可能与幽门螺杆菌和EBV是不同的感染因子有关。LAI等[7]采用PCR-RFLP方法，对取自四川省华西第二医院的120例宫颈癌和100例对照者进行检测分析，证明宫颈癌患病风险与TLR9-2848G/A位点多态性有明显的关系，但与TLR9-1486T/C位点多态性无相关关系。还有研究表明，TLR9基因多态性与前列腺癌及子宫内膜癌发病风险相关，提示TLR9基因多态性在不同肿瘤发生发展中的作用可能有所不同[10-11]。

有研究表明，TLR9具有识别EBV以及产生先天免疫反应的能力，这可能有助于限制病毒的传播以及控制EBV潜伏感染B细胞的增殖；另一方面，EBV可能会干扰TLR9表达和功能，从而影响宿主免疫反应有助于病毒的长期生存。FATHALLAH等[12]采用实时荧光定量PCR检测并比较初始B细胞和淋巴母细胞系的TLR9表达水平，证明EBV潜伏膜蛋白(LMP1)可明显抑制TLR9转录，降低TLR9 mRNA和蛋白质的水平，LMP1通过下调TLR9的转录来逃避先天免疫反应。由于EBVaGC中EBV属于 Ⅰ 型潜伏，并不表达LMP1，所以不存在上述抑制作用。因此，尚需在上述研究基础上对TLR9编码基因其他多态性位点进行检测，增加胃部慢性炎症病人作为病例对照，同时注意外界环境和宿主因素对胃癌形成的影响，进一步明确TLR9基因多态性和EBV感染与胃癌以及EBVaGC易感性的关系。

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(本文编辑 马伟平)

RELATIONSHIP BETWEEN GENE TLR9-1486 AND TLR9-2848 POLYMORPHISMS AND EBVAGC SUSCEPTIBILITY

SHIYuanyuan,HANLu,SHUJun,WANGXiaofeng,LUOBing

(Department of Medical Microbiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between toll-like receptor 9 encoding gene TLR9-1486 and TLR9-2848 site polymorphisms and EBV infection and gastric cancer susceptibility.MethodsThis study consisted of 131 patients with gastric cancer including 43 cases of EBV-associated gastric carcinoma (EBVaGC) and 88 cases of EBV-negative gastric carcinoma (EBVnGC), and peripheral blood specimens taken from 66 healthy individuals served as controls. TLR9 gene-1486 site T/C and -2848 site G/A polymorphism were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP).ResultsTLR9-1486T/C site polymorphism analysis showed there was no significant difference in genotype frequency and allele frequency in gastric cancer group and the control group (P>0.05). There was also no significant difference in each of genotype distribution and allele frequency between EBVaGC group and EBVnGC group (P>0.05). Compared with T allele, the frequency of C allele had no apparently increased risk trend for gastric cancer and EBVaGC. TLR9-2848 site G/A polymorphism analysis showed that there was no significant difference in genotype distribution and allele frequency between gastric cancer group and the control group (P>0.05), and there was also no significant difference in each of genotype distribution and allele frequency between EBVaGC group and EBVnGC group (P>0.05). Compared with G allele, the frequency of A allele showed no obvious risk for gastric cancer and EBVaGC susceptibility.ConclusionTLR9 gene-1486 and-2848 site polymorphism are not associated with gastric cancer, and there is no collaborative relationship with EBV infection in the carcinogenesis of EBVaGC.

stomach neoplasms; toll-like receptor 9; polymorphism, single nucleotide; herpesvirus 4, human

2014-07-20;

2015-01-20

国家自然科学基金资助项目(30970157)、青岛市科技局资助项目(13-1-3-50-jch)

石源源(1985-),女,硕士研究生。

罗兵(1962-)，男，博士，教授，博士生导师。

R735.2

A

1008-0341(2015)03-0260-04