MEF2A启动子多态性对转录活性及冠心病易感性的影响

刘本荣，熊玉娟，钟 赟，莫 沛，李爱群，熊龙根

(1.广州医科大学附属第二医院 心血管疾病研究所，广东 广州510260;2.广州中医药大学第二临床学院 检验科，广东 广州510105)

肌细胞增强因子2A(myocyte enhancer factor 2A，EF2A)是较早被鉴定出来的与冠心病(coronary artery disease，CAD)相关的常染色体显性基因[1]，但其遗传多态是否与CAD 有关存在争议[2]。MEF2A 属于第二类转录调控因子，参与调控心肌转录网络、肌肉组织及血管生成相关特异基因的表达[3-4]，其自身表达受到miR-1的调控[5]。MEF2A和MEF2C 缺陷型诱发扩张性心肌病[6]，MEF2C 调控心肌发育可能是通过调控DOK5 基因的表达而实现的[7]。在小鼠模型中，MEF2A表达单倍型剂量不足更易导致动脉粥样病变，MEF2A 自身的表达调控可能在CAD的发生发展中发挥重要作用，发生在其调控区的遗传多态或变异可能是导致群体或个体对CAD 易感差异的重要原因，然而国内外未见相关报道。本研究通过测序发现MEF2A启动子区的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，利用双萤光素酶报告基因系统研究不同MEF2A启动子单倍型的转录活性，同时比较各单倍型在CAD组和对照组中的频率及纯合率差异。

1 材料与方法

1.1 材料

样本收集及基因组DNA的提取:CAD 患者44名，正常对照45名，各抽取静脉血2 mL，EDTA 抗凝。研究获得广州医科大学医学伦理委员会批准，并与受试者签订知情同意书。

全血基因组提取试剂盒和endo-free plasmid midi kit(广州速研生物公司)，PCR扩增试剂(Toyobo公司)，T 克隆载体pTZ57R/T(中晶生物公司)，限制性内切酶Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ(广州瑞真生物公司)，启动子载体pGL3.0 Basic、pRL-TK 和dual luciferase reporter assay system (Promega 公司)，人冠状动脉内皮 细 胞(human coronary artery endothelial cell，HCAEC)(Sciencell 公司)，lipofectamineTM2000、引物合成和测序(Life Technology 公司)，内皮细胞培养基EGM-2(广州仪涛公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计:以NCBI 数据库中MEF2A 基因序列(NC_000015)为参考序列，利用引物设计软件Primer premier 5.0 进行引物设计。启动子区PCR扩增引物为Kpn Ⅰ_F2AF2:cgg ggtacc CACCTATC TCAGAAAAGGCAAC;Bgl Ⅱ_ F2AR2:ggaagatct G GGGCTATTTTTAGGAGACAAG。测序引物为F2A-S1:CACCTATCTCAGAAAAGGCAAC;F2A-rS1:GGGGC TATTTTTAGGAGACAAG;MEF2AP_seq1:CGATAAG GAGGTTGCTACTG。

1.2.2 PCR扩增:反应体系ddH2O 13.1 μL，10×缓冲液2 μL，DMSO 2 μL，MgSO4(25 mmol/L)0.8 μL，dNTP (2.5 mmol/L)0.5 μL，Kpn Ⅰ-F2A2(10 P)0.3 μL，Bgl Ⅱ-F2AR2(10 P)0.3 μL，KOD Taq 酶(1 U/μL)，gDNA(10～30 ng/μL)0.5 μL，总体积20 μL。PCR 反应条件:95℃预变性1 min，95℃10 s，64℃30 s，68℃1 min，共34个循环，最后68℃延伸3 min。

1.2.3 载体构建:选取12种常见单倍型构建MEF2A启动子载体，载体命名同其代表的单倍型名称，分别为H1、H3、H5、H6、H8、H9、H10、H13、H14、H15、H16和H17，载体构建示意图如图1。连接产物转化感受态细胞(DH5α)，培养过夜，挑取单克隆于3 mL LB 培养基中，37℃培养过夜，提取质粒，测序鉴定。启动子单倍型的确定采用T 载体克隆测序。

图1 MEF2A启动子载体示意图Fig1 Sketch map of the construction of MEF2A promoter vector

1.2.4 细胞培养及转染:HCAEC 培养在含2%FBS 及相关生长因子的EGM-2 培养基中。转染前24 h 铺板，按5 000个细胞/cm2接种细胞，于二氧化碳培养箱(37℃，5% CO2)中培养过夜。用去内毒素质粒提取试剂盒提取的MEF2A启动子载体与pRL-TK 共转染，按lipofectamineTM2000 说明书操作。

1.2.5 启动子活性分析:细胞转染后48 h 进行萤光素酶活性分析，按dual luciferase reporter assay system 说明书操作。萤光素酶活性测定在化学发光检测仪(Lumat LB 9507，德国)上进行。

1.3 统计学分析

序列比对采用clustalx1.81，转录因子结合位点预测采用 TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)，各单倍型转录活性比较、作图及显著性分析采用GraphPad Prism 5，两单倍型间的萤光素酶活性比较采用T-test，所有单倍型的荧光素酶活性比较采用one-way ANOVA 分析，两组间的杂合率比较采用卡方检验。利用Arlequin3.5 进行Hardy-Weinberg 平衡分析。各单倍型的萤光素酶活性以3次独立试验的平均值±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 SNP 及单倍型分析

在1245 bp MEF2A启动子区域发现9个SNP位点，组成18种单倍型(分别为H1，H2，…，H18)，其中H1、H5、H8 和H164种单倍型的频率较高，占79.21%(表1)。3个SNPs 导致转录因子结合位点(transcription factor binding site，TFBS)发生改变(图2)。其中位于启动子－580位C 变为A，导致转录因子ADR1、Sp1的结合位点及GC Box 在此区域丢失(图2A);－646位G 变为T，导致Ttk-69、HSF 结合位点丢失(图2B);－948位C 变为T，导致Sp1 和HSF 结合位点丢失(图2C)。由－948(C/T)、－646(G/T)和－580(C/A)组成的单倍型有CGC(17.98%)、CGA(3.94%)、TGA(36.51%)、TTC(33.15%)、TTA(3.94%)、TGC(3.37%)和CTC(1.69%)，其中包含TGA的单倍型转录活性最高。

表1 MEF2A启动子区的SNP位点及各单倍型的频率分布Table1 The relative position of SNP sites in the promoter region of MEF2A and the frequency of each haplotype in the subjects

2.2 各单倍型启动子的转录活性

H5 和H8 转录活性最高，H1 和H9次之，H1、H3、H6、H10、H13、H14、H15、H16和H17 最低(图3)。含－646 T 等位基因的单倍型(H10、H14、H15、H16、H17)的转录活性低(图3)。各单倍型间的转录活性总体差异显著(P＜0.001)，H8的转录活性显著高于其他单倍型(P＜0.05)。

2.3 冠心病的易感性与MEF2A启动子区的纯合率呈正相关

MEF2A 近端启动子在CAD组中的纯合率达到50%，显著高于对照组中的28.9%(χ2= 4.155，P＜0.05)(图4)。CAD组中的期望杂合率显著高于实际观测值，不符合Hardy-Weinberg 平衡(表2);在对照组中的期望杂合率与实际观测值之间没有明显差异，符合Hardy-Weinberg 平衡(表2)。表明CAD 易感性与MEF2A启动子区的纯合率存在相关性。

图2 预测的MEF2A启动子区的转录因子结合位点Fig2 The predicted transcription factor binding sites in MEF2A promoter region

表2 Hardy-Weinberg 平衡检测结果Table2 Results of Hardy-Weinberg balance test

图3 各MEF2A启动子单倍型的转录活性Fig3 The transcription activity of MEF2A promoter haplotypes(±s，n=3)

图4 MEF2A 近端启动子的纯合率Fig4 The homozygosity of the proximal promoter of MEF2A

3 讨论

研究发现MEF2A启动子区的SNPs 会导致TFBS的改变，由不同SNPs 组成的单倍型具有不同的启动子活性，可见MEF2A启动子区的SNPs 也许会导致不同个体MEF2A的表达水平差异，从而表现出对某些疾病易感性的差异。通常认为，导致TFBS 改变的SNPs 都将致使启动子活性发生变化[8]，MEF2A 近端启动子区中有3个SNPs 可能导致TFBS 丢失，其中含－646(T)的启动子单倍型确实表现出较低的转录活性。然而，由－948、－646和－580 3个SNP位点组成的单倍型中，未丢失任何TFBS的单倍型并未表现出最高的转录活性，而H5 和H8 在－948 和－580位都有TFBS丢失，却表现出最强的转录活性，这种现象可能与基因的稳定性选择有关[9]。因此，仅从SNPs是否导致TFBS 丢失判断其对启动子活性的影响未必准确，必须将由不同等位基因组成的单倍型看作一个整体来考虑，并通过实验验证，探索单倍型与疾病的相关性也许比考察单个SNP 与疾病的相关性更重要。CAD组中MEF2A 近端启动子区的纯合率明显高于对照组，可能是由于MEF2A 在血管内皮及血管平滑肌的修复和功能维护中发挥重要作用，MEF2A启动子区的纯合状态可能导致基因的表达水平不及杂合状态稳定，对外界刺激因子的反应过激或过慢，从而诱发血管病变。可见，MEF2A的表达水平或蛋白活性可能与CAD的发生发展有更密切的关系。

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