CD4+CD25+Treg细胞及其相关细胞因子在HBV感染孕妇胎盘组织中的表达

曾晓明，郑九生，龚维

(江西省妇幼保健院产科，江西 南昌330006)

乙型肝炎病毒(HBV)感染已成为全世界重大公共卫生问题，与各种肝脏疾病的发生、发展密切相关，我国乙肝病毒慢性携带者高达1亿多，其中30%~50%是通过母婴垂直传播感染导致[1]，因此，故控制和减少HBV母婴垂直传播是防治HBV感染的重要途径。宫内感染是HBV母婴传播最主要途径，目前阻断HBV宫内感染的最有效方法为新生儿出生24h内联合使用乙肝高效价免疫球蛋白及乙肝疫苗，但HBeAg阳性孕妇的新生儿有5%~15%阻断失败。因此，有必要进一步研究HBV宫内感染机制，尤其是孕产妇HBeAg阳性时宫内感染率高的机制，以便探讨更有效的阻断方法。

目前对于HBV宫内感染的机制仍不十分明确。近年来，CD4+CD25+Treg细胞(Tregs)对HBV宫内感染影响的研究受到关注。FOXP3是目前公认的Tregs特异的免疫标志[2];IL-10、TGF-β1是Tregs所分泌的抑制性细胞因子，对Tregs的抑制功能具有重要作用[3]。现阶段对于Tregs与HBV宫内感染关系主要集中在孕妇外周血及新生儿脐带血Tregs表达的研究，对于孕妇胎盘组织中细胞因子水平与HBV宫内感染发生的研究较少，在这方面有必要进一步探索。本研究采用免疫组化(二步法)检测HBV宫内感染孕妇胎盘组织中Foxp3表达，将Foxp3作为检测Tregs的指标；同时采用免疫组化法检测胎盘组织中细胞因子IL-10及TGF-β1的表达，研究HBV感染孕妇胎盘组织中Tregs及其相关因子与HBV宫内感染的相关性，探讨孕产妇HBeAg阳性时宫内感染发生率高的机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2012年6月至2014年10月在我院分娩109例HBV感染孕妇作为研究对象(其中HBsAg及HBeAg双阳性58例；HBsAg阳性且HBeAg阴性孕妇51例)，纳入标准：(1)足月、单胎妊娠；(2)HBsAg阳性但肝功能正常；(3)无子痫前期、胎儿生长受限等并发症。HBV宫内感染诊断标准：脐静脉血检测提示HBsAg阳性或合并HBVDNA阳性，考虑HBV宫内感染[4]。

按照HBV宫内感染诊断标准，将发生HBV宫内感染的孕妇设为宫内感染组，将未发生宫内感染的孕妇设为宫内未感染组，两组孕妇的临床资料(年龄、孕产次、孕周)无统计学差异(P>0.05)；依据孕妇HBV血清学标志物检查结果，将HBsAg及HBeAg双阳性孕妇设为HBeAg阳性组；将HBsAg阳性且HBeAg阴性孕妇设为HBeAg阴性组，两组孕妇的临床资料(年龄、孕产次、孕周)无统计学差异(P>0.05)。

1.2 主要试剂 Foxp3鼠抗人单克隆抗体、IL-10兔抗人多克隆抗体购自艾博抗公司；TGF-β1兔抗人多克隆抗体购自福州迈新公司；通用型二抗、DAB试剂盒购自中杉金桥公司。

1.3 实验方法 标本采集：新生儿娩出并断脐后，在胎盘娩出前，抽5ml脐静脉血，送本院检验科检测脐带血HBV-DNA以及乙肝六项；娩出胎盘后，快速用手术刀取小块包括母体面和胎儿面的胎盘组织，采取的部位在胎盘中央附近，避开钙化点，采取面积约2cm×2cm×2cm大小 ，生理盐水洗净，10%多聚甲醛液中固定24h，在病理科脱水，常规包埋制成石蜡块，4℃冰箱内放置保存待用。

采用免疫组化(二步法)检测宫内感染组及未宫内感染组孕妇胎盘组织中Foxp3、IL-10及TGF-β1的表达，Foxp3工作浓度分别为 1：200，IL-10及TGF-β1工作浓度为1：100，具体操作同说明书。每批染色均设阳性对照(Foxp3、IL-10阳性对照片由abcam公司提供，TGF-β1阳性对照片由福州迈新公司提供)和阴性对照(PBS代替一抗)。

1.4 结果判定 阳性细胞判定：细胞具有完整结构，细胞浆呈黄色或棕黄色颗粒，细胞核为蓝色者为阳性细胞；阴性细胞判定：细胞具有完整结构，细胞浆未被染成棕褐色，显示为浅蓝色。半定量分析：在显微镜200放大倍数下观察阳性细胞，每张切片随机观察5个视野，综合阳性细胞所占比例(A)及细胞浆着色深浅(B)计分。 阳性细胞所占比例 (A)：<5% 计 0分，5%～25%计 1分，26%～50%计2分，>50% 计3分；细胞浆着色深浅(B)：无着色计0分，浅棕黄色计1分，黄色计2分，棕褐色计3分。两项指标的计分数相乘(A×B)进行半定量：积分0分为阴性，1～3分为轻度阳性，4～6分为中度阳性，7～9 分为强阳性[5]。

1.5 统计学方法 应用SPSSl7.0软件分析数据，计数资料比较采用χ2检验；细胞因子表达强度采用等级资料秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV宫内感染率 109例HBV感染孕妇共发生宫内感染12例，宫内感染率为11.01%。采用χ2检验方法统计分析，结果显示HBeAg阳性组宫内感染率明显高于HBeAg阴性组(P<0.01)，见表1。

表1 HBV宫内感染率

2.2 胎盘组织中 Foxp3、IL-10、TGF-β1 阳性细胞定位及表达部位 胎盘组织的病理图片均为DAB染色，Foxp3、TGF-β1及IL-10阳性细胞都主要定位于胎盘绒毛滋养细胞、绒毛血管内皮细胞、蜕膜细胞，在绒毛间质细胞有少量表达，表达部位在细胞浆。Foxp3、IL-10、TGF-β1阳性细胞在各组中分布基本一致。各组胎盘组织中Foxp3、IL-10、TGF-β1的表达及PBS阴性对照见图1~6。

2.3 宫内感染组与宫内未感染组孕妇胎盘组织中Foxp3、IL-10、TGF-β1表达的阳性率比较 宫内感染组 Foxp3、IL-10、TGF-β1 在胎盘组织中较宫内未感染组表达的阳性率显著增高，采用秩和检验

图1 Foxp3在宫内未感染组与宫内感染组胎盘组织中的表达(×200)

图3 TGF-β1在宫内未感染组与宫内感染组胎盘组织中的表达(×200)

图5 IL-10在HBeAg阴性组与HBeAg阳性组胎盘组织中的表达(×200)

图4 Foxp3在HBeAg阴性组与HBeAg阳性组胎盘组织中的表达(×200)

图6 TGF-β1在 HBeAg阴性组与HBeAg阳性组胎盘组织中的表达(×200)

方法统计分析，显示差异有统计学意义(P<0.05),见 表2~4。

表2 宫内感染组与宫内未感染组孕妇胎盘组织中Foxp3表达的阳性率[n(%)]

表3 宫内感染组与宫内未感染组孕妇孕妇胎盘组织中IL-10表达的阳性率[n(%)]

表4 宫内感染组与宫内未感染组孕妇胎盘组织中TGF-β1表达的阳性率[n(%)]

2.4 HBeAg阳性组及HBeAg阳性组胎盘组织中Foxp3、IL-10、TGF-β1 表达的阳性率比较 HBeAg阳性组 Foxp3、IL-10、TGF-β1 在胎盘组织中较HBeAg阴性组表达的阳性率显著增高，采用秩和检验方法统计分析，显示差异有统计学意义 (P<0.05)，见表 5~7。

3 讨论

3.1 胎盘组织中CD4+CD25+Treg细胞与HBV宫内感染发生的关系 Tregs是一种具有抑制功能的T细胞亚群 ,能抑制自身反应性T淋巴细胞、CD4+和CD8+T细胞、NK细胞、B细胞及其他免疫细胞的功能[6]。其表面表达很多表面分子，主要有FOXP3、TNFR、CD122、CTLA4、CD134 等[7]， 其 中 Foxp3 是目前公认的Tregs特异的免疫标志，国内也有许多研究检测胎盘组织中Foxp3表达作为胎盘组织Tregs 的指标[8，9]。

表5 HBeAg阳性组与HBeAg阴性组孕妇胎盘组织中Foxp3表达的阳性率[例(%)]

表6 HBeAg阳性组与HBeAg阴性组孕妇胎盘组织中IL-10表达的阳性率[例(%)]

表7 HBeAg阳性组与HBeAg阴性组孕妇胎盘组织中TGF-β1表达的阳性率[例(%)]

辅助性T淋巴细胞 (Th)属于CD4+T细胞亚群，分为Th1和 Th2细胞，Th1细胞产生IL-2和IFN-γ 等细胞因子，Th2 细胞产生 lL-4、IL-10、与IL-13等细胞因子，Th1/Th2细胞处于动态平衡才能维持细胞免疫和体液免疫正常的功能。近年许多研究表明，发生HBV宫内感染时，新生儿及其母亲外周血 Tregs数量增多，并存在Th1/Th2细胞免疫失衡[10，11]。郑九生等采用流式细胞仪检测HBV宫内感染的母亲及其新生儿Tregs表达水平和DAS-ELISA法检测IFN-γ水平及IL-4水平，提示宫内感染组孕妇存在Th1/Th2细胞免疫失衡，Th1细胞免疫反应下调而 Th2细胞免疫反应增强，病毒难以被清除，参与HBV宫内感染[12]。

胎盘中绒毛间隙充满着母体的血液，HBV病毒可以通过感染胎盘再而感染胎儿[13]。但胎盘感染发生的细胞因子机制尚不明确，现阶段对于Tregs与HBV宫内感染关系主要集中在孕妇外周血及新生儿脐带血Tregs水平的研究，对于孕妇胎盘组织中细胞因子水平与HBV宫内感染发生的研究较少，有必要进一步研究。本研究采用免疫组化(二步法)检测HBV感染孕妇胎盘组织中Foxp3表达水平，作为检测 Tregs的指标，研究胎盘组织Tregs表达与HBV宫内感染发生的关系。我们的研究显示胎盘组织中Foxp3阳性细胞主要定位于胎盘绒毛滋养细胞、绒毛血管内皮细胞、蜕膜细胞，在绒毛间质细胞有少量表达，主要表达部位为细胞浆，这与何永文等报道基本一致[8]；宫内感染组孕妇胎盘组织中Foxp3表达阳性率91.6%，明显高于宫内未感染组的42.2%，说明Tregs数量增多可能是HBV宫内感染发生的危险因素之一，推测胎盘感染HBV时，Tregs通过其免疫抑制功能，抑制HBV特异性免疫应答，使清除HBV和抑制炎症反应对组织的损伤达到免疫平衡，当Tregs增多，这种免疫平衡被打破，胎盘组织中HBV难以被清除，导致胎盘感染持续，参与HBV宫内感染的发生。但是目前国内外对于胎盘组织中Tregs与HBV宫内感染的相关研究不多，其发生机制并不明确，胎盘组织中Tregs增多在HBV宫内感染的发生中是否起关键作用并不清楚。

3.2 胎盘组织中TGF-β1和IL-10与HBV宫内感染 TGF-β1和IL-10是具有免疫抑制作用的细胞因子，主要是由Tregs分泌产生，妊娠过程中胎盘滋养细胞也可产生。TGF-β1可以明显抑制T细胞增生及NK细胞、CTL的活性；IL-10可阻止T细胞受体介导的CD4+T细胞的活化，能抑制TNF等细胞因子，两者在免疫功能调节中具有重要作用。周建研究结果发现慢性乙肝患者HBV载量越高，IL-10的水平越高，说明IL-10水平增高不利于HBV 的清除[14]。

解长银等[15]发现，TGF-β1主要表达于胎盘绒毛滋养细胞和蜕膜细胞，主要表达部位为细胞浆 ；赵芳等[16]发现，IL-10主要表达于胎盘合体滋养细胞和细胞滋养细胞中。本实验应用免疫组化二步法对HBV感染孕妇患者胎盘的TGF-β1和IL-10的表达进行定位和半定量检测，结果显示，TGF-β1及IL-10阳性细胞都主要定位于胎盘绒毛滋养细胞、绒毛血管内皮细胞、蜕膜细胞，在绒毛间质细胞有少量表达，主要表达部位在细胞浆。与解长银、赵芳等报道分布基本一致。

同时，我们的研究还显示HBV宫内感染孕妇胎盘组织中TGF-β1和IL-10阳性表达率均较宫内未感染组明显增高，说明胎盘组织中细胞因子IL-10、TGF-β1表达水平升高可能是HBV宫内感染发生机制之一，推测胎盘组织中细胞因子TGF-β1和IL-10表达水平升高时，通过其免疫抑制作用，导致Th1/Th2细胞免疫失衡，HBV特异性免疫应答受到抑制，胎盘组织中病毒难以被清除，导致HBV宫内感染的发生。

3.3 HBeAg阳性与HBV宫内感染 HBeAg是HBV复制和传染的指标，大量研究表明孕妇血HBeAg阳性是HBV宫内感染的高危因素。谢小娟等[17]发现大三阳孕妇宫内感染率其新生儿HBV感染率明显升高，且随HBV-DNA量的升高而增加。我们的研究发现HBeAg阳性组宫内感染率18.96%，远高于HBeAg阴性组(1.96%)，差异有显著意义，说明孕产妇HBeAg阳性会增加HBV宫内感染发生率，这与谢小娟等研究结果一致。

目前关于孕产妇HBeAg阳性增加HBV宫内感染发生风险的机制存在争议，马丽娟等[18]研究认为孕妇HBeAg阳性者其新生儿存在Th1/Th2细胞免疫失衡，导致不能及时有效地清除HBV使宫内感染易于发生；张永臣等[19]研究发现HBeAg阳性组孕产妇的新生儿外周血Tregs明显高于HBeAg阴性组，导致新生儿免疫调节功能低下；也有学者认为HBeAg导致滋养细胞发育不良，使胎盘丧失其对胎儿的屏障保护作用，从而导致宫内感染的发生；而张薇莉等[20]认为HBeAg可选择性通过胎盘屏障进入胎儿体内，使新生儿出生后出现HBeAg血症；

而我们的研究显示HBeAg阳性组胎盘组织中Foxp3、IL-10、TGF-β1 较 HBeAg 阴性组阳性表达率显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明孕产妇HBeAg阳性时，其胎盘组织中存在Tregs增多及其相关因子表达水平升高，推测这可能是HBeAg阳性孕产妇HBV宫内感染发生率高的机制之一。

3.4 总结与展望 综上所述，我们的研究说明：HBV感染孕妇胎盘组织中Tregs增多可能是发生HBV宫内感染的危险因素之一；胎盘组织中IL-10和TGF-β1表达增高可能是HBV宫内感染的发生机制之一；孕产妇HBeAg阳性时，其胎盘组织中存在Tregs增多及其相关因子表达水平升高，推测这可能是HBeAg阳性孕产妇HBV宫内感染发生率高的机制之一。我们推测Tregs增多及其相关因子表达水平升高时，通过其免疫抑制功能，导致Th1/Th2细胞免疫失衡，抑制HBV特异性免疫应答，使胎盘组织中病毒难以被清除，导致感染持续，进一步导致HBV宫内感染发生。

但是目前国内外对于胎盘组织中Tregs与HBV宫内感染的相关研究不多，胎盘组织中Tregs增多及其相关因子表达水平升高在HBV宫内感染的发生中是否起关键作用并不清楚，仍然需要进一步研究，以探索预防HBV宫内感染的更好办法。

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